RNA修飾在生命過程和疾病發生發展中的作用逐漸受到重視，其中5-甲基胞嘧啶（m5C）修飾是熱門研究領域。
本文聚焦于m5C 甲基轉移酶NSUN2在肝癌中的作用，NSUN2通過M5C修飾穩定PKM2 mRNA促進肝癌糖酵解和進展。
m5C修飾是指在RNA分子中，通過特定的酶將胞嘧啶（C）的第5位碳原子上加上一個甲基基團，形成5-甲基胞嘧啶。
這種修飾不會改變RNA的基本核苷酸序列，但會在不改變遺傳信息編碼的基礎上，賦予RNA新的化學和生物學特性。
m5C修飾主要由NSUN（NOL1/NOP2/SUN）家族的甲基轉移酶催化完成，涉及mRNA穩定性與翻譯調控、tRNA 穩定性與解碼功能、
rRNA加工與核糖體功能和非編碼RNA功能調節，廣泛地參與到各種生命活動的調控中。
研究背景：
肝癌（HCC）是常見癌癥及癌癥死亡主要原因，術后轉移復發致患者5年生存率低。RNA 的5-甲基胞嘧啶（m5C）修飾
在多種癌癥中發揮作用，NSUN2是m5C甲基轉移酶，但它在肝癌中的臨床意義、作用機制等尚不明確。
研究方法：
臨床樣本采集與分組：收集125對肝癌（HCC）及相應癌旁組織（ANL），用于RT-qPCR、western blot及IHC分析NSUN2
表達分布與患者臨床特征的相關性，并進行mRNA m5C斑點印跡和m5C-RIP-seq測序。
細胞實驗：主要檢測多株肝癌細胞株的及增殖、遷移和侵襲等細胞行為學改變。
動物實驗：選用5周齡雄性BALB/c裸鼠，在其雙側腋窩皮下接種HCC細胞建立皮下異種移植模型，定期測量腫瘤體積；
通過尾靜脈注射HCC細胞建立肺轉移模型，用活體成像系統監測轉移過程。
其他：RNA免疫沉淀實驗、熒光素酶報告基因實驗、放線菌素D實驗、代謝測量實驗等；
主要研究結果：
（1）NSUN2在HCC組織中的表達上調；
通過對125對HCC和癌旁組織（ANL）的研究，運用蛋白質免疫印跡（WB）和免疫組化（IHC）分析，結果顯示HCC組織
中NSUN2的蛋白水平顯著高于ANL組織。Kaplan-Meier 生存分析，結果顯示NSUN2高表達患者的總生存期（OS）和
無復發生存期（RFS）明顯低于NSUN2低表達患者。此外，對80例HCC患者的臨床病理特征與NSUN2表達進行分析，
發現NSUN2高表達與腫瘤大小、微血管侵犯（MVI）、TNM分期和BCLC分期顯著相關。腫瘤越大、存在微血管侵犯、
TNM分期和BCLC分期越晚，NSUN2的表達越高。
圖1. HCC組織中NSUN2高表達并與HCC不良預后有關。
（2）體內外實驗檢測NSUN2 對HCC生長和轉移的影響
運用慢病毒分別在HepG2和SNU387細胞中穩定過表達NSUN2，在Hep3B和Huh7細胞中穩定沉默NSUN2。
過表達NSUN2能夠促進肝癌細胞增殖和遷移，而沉默NSUN2則抑制肝癌細胞增殖和遷移。體內實驗結果表明，
NSUN2過表達顯著促進了裸鼠皮下瘤生長并增加肝癌肺轉移，而NSUN2沉默則抑制皮下瘤生長和肺轉移。
圖2. NSUN2在體內外誘導肝癌的生長和轉移。
（3）NSUN2介導的m5C修飾在肝癌HCC中的作用
對5對HCC和癌旁正常肝組織進行m5C dot blotting，結果顯示HCC組織中總mRNA m5C 水平高于ANL組織；
m5C-RIP-seq分析顯示HCC和癌旁正常肝組織m5C修飾存在差異，聯合分析mRNA m5C-RIP-seq和 mRNA-Seq數據，
發現HCC中mRNA表達與m5C水平呈輕度正相關；KEGG通路分析顯示，表達和m5C水平均上調的mRNA主要富集在
10條信號通路中，其中癌癥中的中心碳代謝、半乳糖代謝、果糖和甘露糖
代謝等與代謝相關。
圖3. NSUN2介導的m5C高甲基化促進肝細胞癌的代謝轉變。
（4）PKM2是NSUN2介導的m5C修飾的主要靶標
對Hep3B-NSUN2-sh2細胞及其陰性對照進行mRNA測序，結果顯示敲低NSUN2后，236個基因上調，376個基因下調。
將HCC中表達上調的mRNA、m5C 水平上調的mRNA以及 Hep3B細胞中敲低NSUN2后表達下調的mRNA進行重疊分析，
通過維恩圖篩選出11個符合標準的mRNA（B3GNT3、CD7、EML2、FOXC1、GDF15、LRP4、MAPT、MCTP1、PKM2、
PODXL 和 SLC1A7）。檢測這11個mRNA在40對HCC和癌旁正常肝組織中的表達，發現其中7個在HCC中上調。
進一步檢測這7個mRNA在肝癌細胞系中的表達，結果顯示，在HepG2和SNU387細胞中過表達NSUN2后，只有PKM2的表達上調；
在Hep3B 和Huh7細胞中沉默NSUN2后，PKM2的表達下調。此外，根據m5C-RIP-seq結果，
PKM2 mRNA上調的m5C峰位于其3′ - UTR（chr15:72491753 - 72491855，hg19）。通過針對該峰的m5C-RIP-qPCR驗證了這一結果，
進一步表明PKM2 mRNA是NSUN2作用的主要靶標。
圖4. PKM2 mRNA是NSUN2作用的靶標。
（5）NSUN2通過增加m5C水平穩定PKM2 mRNA
通過放線菌素D處理HCC細胞，并在不同時間點利用RT-qPCR分析PKM2 mRNA水平。結果顯示，過表達NSUN2會減緩
PKM2 mRNA的降解，而沉默NSUN2則加速其降解。m5C-RIP-qPCR發現SNU387細胞中過表達NSUN2后，PKM2 mRNA m5C
水平升高；在 Hep3B細胞中沉默NSUN2后，其m5C水平降低；隨后，使用針對PKM2的m5C峰的引物和經亞硫酸氫鹽轉化
RNA逆轉錄的cDNA模板進行亞硫酸氫鹽PCR，然后進行Sanger測序，發現在chr15:72491773（hg19）位點（C773）的信號中，
既有胞嘧啶（‘C’）又有胸腺嘧啶（‘T’），這表明該位點在HCC組織和細胞系中均發生了m5C 甲基化。通過計算各樣本中
C773位點的m5C水平，發現HCC組織中的m5C水平高于癌旁正常肝組織。同時，SNU387細胞過表達 NSUN2后該位點m5C水平上升，
Hep3B細胞沉默NSUN2后該位點m5C水平則下降。最后，構建含有野生型3′-UTR的PKM2 mRNA（PKM2-WT）和突變型 C773
（PKM2-Mut）的質粒進行熒光素酶報告基因實驗。結果表明，過表達NSUN2可增加 PKM2-WT的熒光素酶活性，對PKM2-Mut
則無此作用；沉默NSUN2的效果則相反表明 NSUN2 對PKM2的調控作用依賴于m5C位點C773。
圖5. NSUN2通過增加m5C水平穩定PKM2 mRNA。
（6）NSUN2通過上調PKM2促進HCC的糖酵解和進展
通過檢測過表達和敲低NSUN2后HCC細胞的葡萄糖攝取、乳酸生成、細胞外酸化率（ECAR）和糖酵解質子外流率（glycoPER）
來評估糖代謝變化。發現過表達NSUN2顯著增加了葡萄糖攝取、乳酸生成、ECAR和glycoPER，敲低NSUN2則降低了這些指標，
表明 NSUN2 促進HCC細胞的糖酵解。
圖6. NSUN2通過上調PKM2促進HCC的糖酵解和進展。
隨后，使用siRNA靶向PKM2，發現其可下調PKM2四聚體、二聚體和單體的表達，而過表達NSUN2可減緩這種下調作用。
敲低PKM2抑制了葡萄糖攝取、乳酸生成、ECAR和glycoPER，而過表達NSUN2可部分阻斷這些抑制作用，表明NSUN2 對
HCC糖酵解的促進作用部分通過上調PKM2實現。最后，檢測了PKM2對HCC細胞生長和侵襲的影響及NSUN2的作用，發現
敲低PKM2抑制了HCC細胞的生長和侵襲，而過表達NSUN2可阻斷這種抑制作用，說明NSUN2通過上調PKM2促進HCC細胞
的生長和侵襲。
（7）研究示意圖
直觀地展示從NSUN2表達上調，到PKM2 mRNA穩定、PKM2蛋白增加，再到促進HCC糖酵解、細胞增殖和遷移的一系列過程，
為理解HCC的發病機制提供了重要的理論依據，也為后續研究潛在的治療靶點提供了方向。
圖7. NSUN2介導PKM2在HCC中的m5C調節機制示意圖。
研究總結：
肝癌中NSUN2表達上調且與預后不良相關；NSUN2通過增加PKM2 mRNA的m5C修飾穩定其表達，促進糖酵解，進而推動肝癌進展，
研究shou次明確PKM2是NSUN2介導m5C修飾的靶基因，揭示NSUN2促進肝癌進展的關鍵機制。綜合多種實驗方法，從細胞、
動物模型及臨床樣本quan方位驗證，NSUN2可作肝癌預后指標和治療靶點，為肝癌臨床診療提供新思路。
參考文獻
Qi, Q., Zhong, R., Huang, Y. et al. The RNA M5C methyltransferase NSUN2 promotes progression of hepatocellular
carcinoma by enhancing PKM2-mediated glycolysis. Cell Death Dis 16, 82 (2025).
