熱獻 差示掃描量熱儀解析DNA熔融的顯微結構

　　差示掃描量熱儀解析DNA熔融的顯微結構
 

　　1.   簡介
 

　　擔負著遺傳信息的DNA，即使是歸類于小種類的大腸菌，其染色體DNA的大小也巨大到約4700kb(1kb=1000堿基對)，如果就這樣處理的話是很困難的，染色體DNA獨立地存在于細胞質，進行自律增殖數質粒DNA小到數kb到數百kb，處理起來比較容易，所以經常被分子生物學作為研究對象或者研究手段。小型的質粒DNA，作為物理化學的研究對象也是便利的材料。
 

　　DNA是由鳥尿環(G)，胞嘧啶(C)，腺嘌呤(A)，胸腺嘧啶(T)4種堿基的共有結合而形成的2條互補鏈，通過GC間和AT間的氫結合以及鄰接堿基對間的如垛狀的弱結合力形成的2根鏈。因為具有這種構造的DNA在比較低的溫度下解離(被稱為融解或者螺旋-線圈轉變等)成一條鏈，通過很多物理手段是可以觀測的。又因為其比較簡單的模型，所以將其進行理論化也相對比較容易。另外DNA的融解與細胞內復制、轉寫、重組等的遺傳基本現象有關，所以也成為了生物學和物理學的連接橋梁。
 

　　我們知道DNA的融解是在數十堿基對到數百堿基對間共同發生的。這被稱為融解的顯微結構，此現象到目前為止主要通過紫外吸收、電子顯微鏡、凝膠電泳等方法觀察的。雖然通過熱測定來解析顯微結構的報告目前為止是沒有的，這是因為熱測定中使用的DNA是染色體DNA和合成核苷酸這種巨大的DNA，或者如Oligo一樣是極小的DNA構成的。比如染色體DNA的場合，因為個體過于大，各個顯微結構重合成一個整體，所以只能觀測到一個幅寬的波峰，而合成核苷酸的場合，因為堿基排列均一而且個體小，所以其特性會擴及分子整體從而影響結果。
 

　　通過不斷的實驗，我們發現使用被稱為pJL3-TB5的5277堿基對而來的質粒DNA，初次對DNA融解的顯微結構利用差示掃描量熱儀(DSC)是可以測定的。而且，通過全堿基排列的理論性計算，就可以利用DSC曲線來解析堿基排列和遺傳因子。
 

　　這里，將闡述DSC測定Co/E1質粒得理論性解析結果。
 

　　Co/E1是從6646堿基對而來，是產生抗菌性物質大腸桿菌素E1的遺傳因子cea堆積的質粒。而且Co/E1可以通過添加氯霉素來增加其產量，有容易得到樣品的優點。
 

　　2.   方法
 

　　樣品：前述的Co/E1質粒用銫-溴化乙錠法，再通過2次的超遠心分離精制而成。得到的質粒由于變為閉環狀，所以難以產生融解不能觀測顯微結構。限制性內切酶EcoRI因為只識別Co/E1這個單一的位置，所以通過EcoRI切斷Co/E1使其變為直鏈狀。
 

　　用上述精制的Co/E1DNA330μg溶于60μl的1×SSC緩沖液(實際上是通過超濾溶媒置換)，放入70μl的密封樣品容器中進行測定。升溫速度0.5K/min。
 

　　通過利用融解曲線和變性圖進行理論計算：對于Co/E1DNA的全堿基排列6646堿基對，用AT和GC這2種進行分配參量，并分別在69.5℃和110.5℃時進行計算。
 

　　3.   DSC曲線
 

　　圖1-(1)是用上述方法得到的Co/E1DNA的DSC曲線。83℃開始到98℃能看到DNA階段性的融解時的11個波峰。(2)是降溫過程的DSC曲線，顯示了暫時從1根鏈中解離的DNA再度和2根鏈會合的過程，(3)顯示的是再升溫過程的DSC曲線，再會合的2根鏈DNA再次解離的過程。曲線(2)，(3)的各波峰分離雖然沒有(1)那樣好，會合、再融解的反應也是階段性進行的。曲線(4)是通過理論推斷得到的融解曲線。這里縱軸表示的是各溫度下螺旋線含量的溫度微分。(1)和(4)的各波峰標注的號碼，表示分別對應的波峰。雖然有若干的差異，但是DSC曲線和理論曲線近乎一致。這表示理論推斷的可信性相當高，使得進一步的解析變得可能。
 

　　4.   變性狀態的理論性解析(變性圖)
 

　　通過觀察DSC曲線上各波峰前后的DNA變性狀態，可以知道分子鏈上哪一個領域的融解分別對應哪個波峰。因此變性圖是將某個溫度下各堿基對變成線圈狀態(解離狀態)的概率對應到各堿基對位置而制成的圖表。圖2顯示的是圖1-(4)的理論融解曲線中，各波峰的前后用a.b.….j表示的各溫度的變性圖計算結果。圖的橫軸，通過限制酵素EcoRI將切斷點作為原點。涂滿黑色的地方是融解的部分。DSC曲線上各波峰，是DNA分子鏈哪個部分的融解就很容易了解到。比如，DSC曲線的波峰1，相當于圖2的變性圖中a的狀態變化為b的狀態，是堿基位置100到400的領域的變性和5050到5200的小區域的變性疊加的結果。而且，從此圖可以了解到融解是互相協同進行的。比如圖的左側的低溫下融解的部分，到相當高的溫度為止融解雖然不是向內部進行，但是在某一溫度下會急速的在廣區域中融解的現象產生。右側部分也可以看到是同樣的共同融解。這樣的情況如果做成熱穩定性圖的話會變得更加明了。
 

　　5.   變性圖和遺傳因子圖的比較
 

　　圖2的上部，顯示的是Co/E1的遺傳因子圖。和變性圖比較的話在遺傳因子的頂端(涂層區域和非涂層區域連接部分)很多場合溶解的方式是在變化的。也就是，表示涂層區域和非涂層區域穩定性上存在差異。與圖2相鄰的變形圖之間取差或者制作熱穩定性地圖進行調查的話，這個情況更加明顯。如此融解區域內存在差異，是否僅僅是反映進化過程中堿基置換或重組，還是對于遺傳性機能發現有特別的意義是一個有趣的問題，現在仍然不是很清楚。