紫外-可見二極管陣列用于多波長動力學分析的優勢

前言：采用分光光度法監控反應底物的減少或反應產物的增加，可以跟蹤對-硝基苯基乙酸酯 (pNPA) 的水解反應過程。監控濃度變化的速率可以確定反應的速率。Agilent Cary 8454 紫外-可見二極管陣列分光光度計只需 0.1 秒的時間就能夠獲得全光譜。您可以根據需要隨時從儲存的光譜數據中提取出隨時間變化的吸光度。由于包含整個波長范圍的數據是在同一個實驗里同時獲得的，因此，可以對不同波長的結果進行準確的闡釋，為反應機理的研究提供有用的信息。

采用傳統的掃描分光光度計，通常能夠比較方便地在單一波長或者選定的幾個波長上跟蹤反應的動力學過程，如果反應非常快速，則使用分光光度計是必需的。對于 pNPA 的水解反應過程，可以在 270 nm 下監控 pNPA 的消耗或在405 nm 下監控對-硝基苯酚的生成。然而，由于沒有監控整個光譜范圍，有可能漏掉實現數據準確分析所必需的重要數據。除了快速、精確的測量，精確的溫度控制對于準確的動力學測量也是至關重要的。根據所研究的反應不同，僅僅 1 °C 的變化就有可能導致觀測到的反應速率發生重大變化。AgilentCary 8454 提供的帕爾貼溫度控制附件（部件號 89090A）可以精確控制溫度，能夠加熱或冷卻樣品，還能利用溫度探頭測量樣品的溫度。

實驗部分：在堿性溶液中，pNPA 會按照下面的方程式水解為對-硝基苯酚：

從原理上講，這是一個二級反應，但如果存在過量的水，則會表現出偽一級反應動力學。反應速率對 pH 值和溫度較為敏感。將 2.9 mL 的 0.1 M 磷酸緩沖液 (pH 8.5) 加入到比色皿中，然后將其放入恒溫的比色皿支架中使其達到平衡。樣品的精確溫度由一個外置溫度傳感器選件測定，該傳感器尺寸很小，有玻璃外罩以保持惰性。

環繞在樣品池周圍的鋁塊的溫度由帕爾貼溫度控制器控制。樣品池與鋁塊緊密接觸以盡可能減小溫度差異。預設溫度與樣品實際溫度之間只有很微小的差異。在比色皿中加入3 mL 蒸餾水，就可以用外置傳感器來測定不同溫度下二者之間的差異（圖 2）。盡管如此，監控得到的溫度是通過外置傳感器測得的實際樣品的溫度，這就保證了最高的溫度精度。當反應溫度達到平衡時，將 50 µL 溶于無水乙腈的對-硝基苯基乙酸酯儲備液加入比色皿開始反應，并用攪拌器以700 rpm 的速度混合反應物。以時間間隔自動獲取譜圖，該時間間隔是根據反應溫度和速度進行調節。圖 3 顯示了 55 °C 時反應體系的光譜，測量間隔為 125 秒。

如果在一定的波長范圍內不斷重復記錄變化的吸收光譜，這些譜可能在一個或多個波長處發生交叉（圖 3）。這些交叉點稱為等消光點，它表示反應物與產物之間發生的是單相反應（也就是沒有副反應或串連反應）。圖 3 所顯示出的精確的等消光點表明了 Agilent Cary 8454 紫外-可見分光光度計在整個反應時間里的光學和溫度穩定性。

采用紫外-可見光化學工作站，您可以很容易地打開已經收集保存的數據并在任意波長內對數據進行重新分析。在這個例子中，在數據采集完成后，可以提取出單波長 (405 nm)下對-硝基苯酚生成過程的數據以獲得反應動力學參數。在這個波長下，沒有其他組分的吸收（圖 4）。采用紫外-可見光化學工作站軟件中的動力學模式計算得到的 55 °C 時的偽一級速率常數為 1.24 x 10-3 s-1。這種動力學模式是生化分析附加模塊 (G1117AA) 的組成部分。

結論Agilent Cary 8454 可見-紫外光分光光度計是酶催化反應或化學反應動力學分析的理想工具。本文展示了帕爾貼溫度附件在反應溫度可靠控制方面的有效性，它使得儀器在整個動力學分析期間具有穩定性。二極管陣列分光光度計具有許多優點，其全光譜采樣時間僅僅只需 0.1 秒。全光譜采集功能讓用戶能夠獲得反應相關的所有數據。它能讓用戶在數據采集之后方便快捷地在任何波長下對反應速率進行處理。另一方面，通過監控一定的波長范圍，光譜可用于多組分分析以確定在各個測量時間點反應底物和產物的濃度。