大鼠滑膜細胞的制備方法

　　大鼠滑膜細胞的制備方法：
 

　　滑膜細胞的培養：將分離的滑膜組織用含青霉素200kU/L、鏈霉素200mg/L的D-Hank's液漂洗3次以減少污染機會；去掉脂肪組織，將16個滑膜組織樣本平均分為A、B兩份。將A份不加處理分為A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8八個樣品，將B份用手術剪剪碎后分為B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8八個樣品。分別采取4種不同方法進行處理。
 

　　1)不加消化酶消化法：分別將A1、A2、B1、B2離心洗滌2次(2500r/min，離心6min)，吸棄上清液，加入100μL100%的FBS混勻，用移液槍吸出注入培養瓶中，放入CO2培養箱烘干15min，再將A1、B1加入3mL體積分數20%的FBS吹打均勻，A2、B2用少量體積分數20%的FBS人工貼壁，再加入3mL體積分數20%的FBS。
 

　　2)加Ⅱ型膠原酶消化法：將A3、A4、B3、B4離心洗滌2次(2500r/min，離心6min)，吸棄上清液，吸取膠原酶Ⅱ至離心管中，輕輕吹打使組織塊重新懸浮，移入培養瓶，放入CO2培養箱消化，觀察組織成絮狀后，加入1mL體積分數20%FBS終止消化，用移液槍吸出，移入離心管離心(2500r/min，離心6min)，棄上清液，放入培養瓶中，A3、B3加入3mL體積分數20%FBS，吹打均勻；A4、B4用少量體積分數20%的FBS人工貼壁，再加入3mL體積分數20%的FBS。
 

　　3)加胰蛋白酶消化法：將A5、A6、B5、B6離心洗滌2次(2500r/min，離心6min)，吸棄上清液，吸取胰蛋白酶至離心管中，輕輕吹打使組織塊重新懸浮，移入培養瓶，放入CO2培養箱消化，觀察組織成絮狀后，加入體積分數20%FBS終止消化，用移液槍吸出，移入離心管離心(2500r/min，離心6min)。棄上清液，放入培養瓶中，A5、B5加入3mL體積分數20%FBS，吹打均勻；A6、B6用少量體積分數20%的FBS人工貼壁，再加入3mL體積分數20%的FBS。
 

　　4)先加Ⅱ型膠原酶消化法再加胰蛋白酶消化：將A7、A8、B7、B8離心洗滌2次(2500r/min，離心6min)，吸棄上清液，吸取膠原酶Ⅱ至離心管中，輕輕吹打使組織塊重新懸浮，移入培養瓶，放入CO2培養箱消化，觀察組織成絮狀后，取出培養瓶，仔細吹打使組織塊分散，將未黏附細胞移入離心管離心(2500r/min，離心6min)，棄上清液，再加D-Hank's液洗滌，離心，吸棄洗滌液，重復離心3次，吸取胰蛋白酶至離心管中，輕輕吹打使組織塊重新懸浮，移入培養瓶，放入CO2培養箱消化，消化結束取出培養瓶，加入體積分數20%FBS終止消化，用移液槍吸出，移入離心管離心(2500r/min，離心6min)。棄上清液，放入培養瓶中，A7、B7加入3mL體積分數20%FBS，吹打均勻；A8、B8用少量體積分數20%的FBS人工貼壁，再加入3mL體積分數20%的FBS。
 

　　5)結果：培養9d后，觀察各培養瓶中細胞的成活個數和生長狀況，組織剪碎不加消化酶人工貼壁培養的細胞得數為2.03×106，是所有培養方法中細胞的數最多的。細胞活力為95%，與組織剪碎加膠原酶Ⅱ消化后人工貼壁培養同為各種培養方法中細胞活力*強的，綜合考慮*方法為組織剪碎不加消化酶人工貼壁培養。