應用 | 天然產物提取巧方法-高效制備香蘭素

概述

香蘭素（圖 1）是天然香草的主要成分，是世界范圍內使用非常廣泛和非常重要的調味材料之一。

香蘭素可以從熱帶香草蘭(主要是 Vanilla planifolia Andrews) 1的豆子或豆莢中提取、重組生產或合成。食品配方中使用的純香蘭素的來源可以通過其同位素特征2來區分。該方法可能需要先進行初步純化。

在本研究中，使用香草的乙醇粗提物來對比VERITY® PLC 2050 系統與不同類型色譜柱配合使用的能力。在 HPLC 制備柱和 CPC PRO 上進行香蘭素（Vanillin）的制備純化。對比了兩種技術所獲取最終的香蘭素純度、溶劑消耗和進樣量。

離心分配色譜技術是什么？

它全稱Centrifugal Partition Chromatography, 由Nunogaki發明，簡稱CPC。CPC屬于現代逆流色譜技術的一種，它和滴流逆流色譜（DCCC）、旋轉腔式逆流色譜（RLCCC）以及回旋腔室逆流色譜（GLCCC）等同屬于非螺旋管式的逆流色譜。

離心分配色譜技術的原理

和以硅膠顆粒等材質作為固定相以及有機溶劑作為流動相的傳統HPLC色譜有所不同，離心分配色譜技術的原理和液液萃取相似，都是利用待分離物質在兩種互不相溶的有機溶劑中不同的溶解度作為基礎，將其中一種溶劑作為固定相，另外一種作為流動相。

離心分配色譜的技術優點

離心分配色譜技術和利用色譜柱的制備色譜相比，其使用成本更低。最大的優點就是為用戶節省了色譜柱這個耗材，CPC利用的是不銹鋼旋轉式分離柱，不需要頻繁的更換。CPC技術在對有機溶劑的消耗量上也更為節省，在分離過程中不需要使用大量的流動相來沖洗色譜柱。

由于不使用硅膠顆粒這類較為脆弱的分離介質，當科學家采用離心分配色譜儀進行目標物的制備純化時，待分離的產物無需經過前處理就可以直接進樣。

CPC技術可以兼容多肽和蛋白質的分離，沒有樣品損失，堅實耐用，可以直接從實驗方法向工業分離進化。

離心分配色譜(CPC)應用的優勢

• 可從 6.3 g 粗提物獲得 500 mg 的純香蘭素，并進一步同位素分析確認其特性。

• 制備型高效液相色譜法與離心分離色譜法在香蘭素純化方面的比較。

解決的問題

• 一套制備型液相系統 (PLC 2050) 可以同時適應制備高效液相色譜法和離心分離色譜法。
• 與制備高效液相色譜相比，離心分離色譜(CPC 250 PRO) 是復雜提取物處理的更佳選擇。
• 大幅度減少溶劑消耗，降低成本和對環境的影響

材料和方法

01.系統

純化儀器

圖 2 搭載離心分離色譜儀(左)的 PLC 純化系統 (右)

圖 3 裝載制備液相色譜柱的 PLC 2050

Gilson VERITY CPC 250 Pro 離心分配色譜儀(圖2)， 或者 Merck 公司的制備 HPLC 色譜柱 Hibar 250 X25, C18, 5μm (圖3) 連接到 Gilson PLC 2050 系統, 該系統配有一臺 50 mL/min 的四元梯度泵，一臺紫外檢測器, 一臺餾分收集器及配套的 Gilson Glider 軟件。

配備波長范圍200-800nm二極管陣列檢測器 (PDA)的HPLC系統

02.樣品

香草的乙醇粗提物首先進行 HPLC 分析 (表 1)。香蘭素在 rt = 9.9 分鐘出峰， 280 納米處峰值面積為 63.7%, (圖 4)。

表1 HPLC分析條件

圖 4 粗提物在280nm的HPLC分析色譜圖

通過外標對照品校正， 粗提物種中香蘭素的含量約為 9% (w/w) 。提取物中大部分的分子沒有被紫外檢測到。

制備 28 g/L 的香蘭素提取物溶液用于離心分離色譜進樣， 同時制備 0.08g/L 的低濃度樣品用于制備HPLC，以避免進樣壓力過高。

03.方法

制備高效液相色譜與離心分配色譜所運行的方法分別詳見表 2 和表 3。當使用制備高效液相色譜時，進樣 90 mg 的粗油， 以 20mL/min 的流速等度洗脫。當使用離心分離色譜時，進樣 6.3 g 的粗油， 以30mL/min 的升相模式洗脫。

表2 制備液相色譜條件

表3 制備液相色譜條件

將純化后的產物進一步進行HPLC 分析，在 280nm 下檢測香蘭素。

結果和討論

最終得到的制備色譜圖如圖 5 和圖 6 所示。兩個色譜圖中的藍色區域代表收集的香蘭素餾分。這些餾分進一步使用 HPLC 進行分析，在 280nm 下的檢測結果如圖 7 和圖 8 所示。

圖 5 制備色譜在280nm處的紫外色譜圖

圖 6 VERITY CPC 250 PRO在280nm處UV色譜圖

這些餾分進一步使用 HPLC 進行分析，在 280nm 下的檢測結果如圖 7 和圖 8 所示。

圖 7 通過制備色譜柱純化，收集的香蘭素餾分合并后，在280nm處HPLC分析圖譜

圖 8 通過VERITY CPC 250 PRO離心分配色譜柱純化，收集的香蘭素餾分合并后，在280nm處HPLC分析圖譜

兩種技術都能獲得純度大于 99% 的香蘭素（表 4）。此外，使用 CPC 的回收率大于 91.8%（表 4）。這表明 CPC 能夠避免由于潛在的不可逆吸附而導致的樣品損失。

在制備型 HPLC 中洗脫香蘭素需要 500毫升溶劑（圖 5），而在 CPC 中洗脫香蘭素僅需使用 360 毫升溶劑（表 4）。由此可以得出，每進樣 1 g的原料，制備型 HPLC 需要使用 5.3 升的溶劑，而 CPC 只需要使用 0.1 升的溶劑。

本研究中由于制備型 HPLC 的進樣量低，無法得到回收的香蘭素的質量和產率。

表 4 通過制備色譜法和離心分配色譜法對香蘭素進行純化的結果對比

結論

PLC 2050 能夠高效便捷地與 CPC 和 prep HPLC 色譜柱搭配使用，用來進行純化工作。在本文中， 通過對比 CPC 與 HPLC 制備柱，展現了 CPC 的優勢（表 4）。與 prepHPLC 相比， CPC 溶劑消耗量更低且無需固定相（如二氧化硅），進樣量更大，而純化效率近似。這些基于實驗室級儀器得到的純度，產量，產率等數據，可以放大并應用到工業級 CPC （如 Gilson VERITY 工業級 CPC ）解決方案。

參考文獻：
1.Vanillin; Walton N.J. and Al; Phytochemistry, 63, (2003), 505-515
2.Zietlow et. al. Journal of Agricultural and Food Chemistry 50(22):6271-5