載體構(gòu)建及原核表達(dá)

      大腸桿菌表達(dá)載體要求：①有一個強(qiáng)的啟動子及其兩側(cè)的調(diào)控序列；②應(yīng)有SD序列，且SD序列與起始密碼子ATG之間要有合適的距離；③在克隆基因與啟動子之間有正確的閱讀框架；④外源基因下游應(yīng)加入不依賴ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。

構(gòu)建好表達(dá)載體之后，提取重組載體的質(zhì)粒，然后用質(zhì)粒進(jìn)行表達(dá)宿主菌的轉(zhuǎn)化。

NCBI上查找目的基因SD序列，使用Primer 5軟件進(jìn)行引物的設(shè)計，在設(shè)計引物時須引入合適的酶切位點和保護(hù)性堿基，具體可查看本公眾號分享的引物設(shè)計。

1.2 PCR擴(kuò)增（以Q5酶擴(kuò)增為例）

PCR體系（25 μl）：

1.3 瓊脂糖凝膠電泳

      根據(jù)目的條帶大小配置相應(yīng)濃度的瓊脂糖凝膠，微波爐加熱，全部溶解后，冷卻至60℃左右，按照1：10000加入核酸染料，混勻后倒入凝膠鑄槽中，插入梳子，除去氣泡，待全部凝固后拔出梳子。

將凝膠置于電泳槽中，加樣孔放置于負(fù)極，進(jìn)行加樣（選取合適的DNA Marker），根據(jù)DNA Marker指示條帶在凝膠上的位置決定電泳是否終止，然后將凝膠放置在凝膠成像儀中切膠回收。

2.目的片段和表達(dá)載體的連接（以T4連接為例）

    不同的表達(dá)載體具有不同的優(yōu)勢，在分析基因序列之后可以選擇最佳的表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建。因科研需求，需要pET系列、pGEX系列、pCold(BL21分子伴侶)系列等原核表達(dá)載體。

b. 連接載體酶切：37℃ 1 h

3.目的蛋白的表達(dá)

3.1 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化并挑取陽性克隆質(zhì)粒

a.從-80℃取出感受態(tài)細(xì)胞，放在冰上融化；

b.將10μL連接產(chǎn)物全部加入到50 μL感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30 min；

c.將EP管放在42℃熱激1 min 30 s，速置冰中3 min；

d.向EP管中加入440 μL無抗的液體LB，置于搖床上37℃220 rpm培養(yǎng)1 h；

e.取適量活化后菌液均勻涂布于含抗性（與載體上抗性基因一致）的固體LB培養(yǎng)基上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置12-16 h；

f.轉(zhuǎn)化后挑取陽性克隆質(zhì)粒，經(jīng)測序鑒定無誤后進(jìn)行后續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)實驗。

3.2 提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21

a.將鑒定正確的表達(dá)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞（和轉(zhuǎn)化同理）；

b.挑取單菌落接種至含抗性（與載體上抗性基因一致）的液體LB培養(yǎng)瓶中，置于搖床上37 ℃ 220 rpm培養(yǎng)過夜；

c.將過夜培養(yǎng)的菌液以1:100的比例接種于含抗性（與載體上抗性基因一致）的液體LB培養(yǎng)瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)；

d.待OD600=0.6-0.8時，取1mL菌液作為未誘導(dǎo)全菌樣品對比，并向剩余菌液中加入終濃度為0.5 mM的IPTG，置于搖床上低溫180 rpm誘導(dǎo)過夜。

3.3 超聲破碎菌液

a.從過夜誘導(dǎo)后的菌液中取1mL作為誘導(dǎo)后全菌樣品對比，收集剩余菌液離心（8000 rpm，20 min，4℃）棄上清用PBS重懸濃縮（濃縮比例約10:1）；

b.超聲破碎（超聲4 s，停歇7 s）至透亮，結(jié)束后離心（10000 rpm，30min，4℃）分別收集上清和沉淀，將其作對照組取樣；

c.取誘導(dǎo)前全菌，誘導(dǎo)后全菌，誘導(dǎo)后上清，誘導(dǎo)后沉淀各40μL，加入10 μL 5×loading buffer，于99℃變性20min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

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