單細胞DNA甲基化與轉錄組分析揭示豬生發泡卵母細胞成熟的關鍵調控機制

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在哺乳動物中，竇卵泡內的生發泡(germinal vesicle，GV) 卵母細胞可以保持數月或數年的靜止狀態。促黃體生成素(luteinizing hormone，LH)激增促進了減數分裂（meiosis）恢復，使卵母細胞獲得受精后和早期胚胎發育能力。同時還需要卵母細胞和粒細胞(granulosa cell，GC)之間高度復雜的激素和能量互相交流（Bi?directional communication），以及內分泌和旁分泌信號的分子調控以促進細胞核和細胞質成熟。闡明竇卵泡中卵母細胞獲得能力的分子程序對人類輔助生殖技術的成果和提高家育能力具有重要意義，單細胞組學技術為闡明哺乳動物卵母細胞生長的早期分子機制提供了新的機會。

2023年7月22日，華南農業大學動物科學學院副教授袁曉龍博士等為作者在《Cellular and Molecular Life Sciences》期刊以“Single-cell multi-omics profiling reveals key regulatory mechanisms that poise germinal vesicle oocytes for maturation in pigs”為題發表研究論文，該研究利用單細胞DNA甲基化測序（scBS-seq）和單細胞轉錄組測序（SMAART-seq2）等單細胞多組學分析技術揭示了豬生發泡卵母細胞成熟的關鍵調控機制，闡明哺乳動物卵母細胞從減數分裂停止到減數分裂恢復的分子機制。深圳市易基因科技有限公司提供本研究的單細胞DNA甲基化測序（scWGBS）和單細胞轉錄組測序（Smart-seq2）分析服務。

標題：Single-cell multi-omics profiling reveals key regulatory mechanisms that poise germinal vesicle oocytes for maturation in pigs（單細胞多組學分析揭示了豬生發泡卵母細胞成熟的關鍵調控機制）

發表期刊：Cellular and Molecular Life Sciences      

發表日期：2023年07月22日    

影響因子：IF 8

技術：單細胞全基因組重亞硫酸鹽測序（scWGBS）、單細胞轉錄組測序（Smart-seq2）等

研究摘要

本研究以青春期母豬卵巢不同大小竇卵泡中的卵母細胞為研究對象，采用單細胞M&T-seq技術（scWGBS + Smart -seq2）對62個卵母細胞的細胞核DNA甲基化組和細胞質轉錄組進行平行分析。同時利用10×單細胞轉錄組分析了竇卵泡內細胞間互相交流機制。本研究開發了methyConcerto分析包以專門和全面表征單細胞甲基化譜和等位基因特異性甲基化。對豬竇卵泡中單個卵母細胞的基因表達和DNA甲基化進行了表征，活性和非活性基因體都顯示出高甲基化水平，從而定義為兩種不同類型的卵母細胞。盡管II型卵母細胞甲基化水平高于I型，但II型的細胞質轉錄本數量是I型的近兩倍。此外，II型卵母細胞的印跡甲基化模式差異比I型大，II型卵母細胞的基因表達和DNA甲基化與MII卵母細胞更相似。粒細胞和II型卵母細胞之間的串擾活躍，這些觀察結果表明II型卵母細胞更容易成熟。最后通過體外成熟實驗進一步驗證了胰島素信號通路中的胰島素受體底物-1（IRS1）是成熟的關鍵調控因子。本研究為哺乳動物卵母細胞減數分裂停滯和減數分裂恢復之間的調控機制提供了新的見解，同時還為未來的單細胞甲基化組學研究提供了新的分析包。

材料方法

210日齡的青春期長白豬(Landrace,L)×大白豬(Yorkshire,Y)二元雜交母豬腹膜內注射5 IU孕馬血清促性腺激素（PMSG）以刺激卵泡發育。48小時后從母豬身上解剖卵巢，分離出細胞質均勻的裸露卵母細胞并用1% BSA-PBS洗滌三次。用于免疫熒光實驗的卵母細胞在–80°C下儲存，直到進一步處理。用于單細胞實驗的卵母細胞立即處理收集在8μL細胞裂解緩沖液中。

研究結果

（1）細胞質的單細胞轉錄組分析（Smart-seq2）揭示母豬竇卵泡中兩種不同的卵母細胞類型

解剖4只青春期母豬的卵巢，并從5個不同大小的竇卵泡中分離出卵母細胞，共收集62個卵母細胞。根據其竇卵泡的大小將其分為五組：AF1代表竇形成階段的卵母細胞（卵泡直徑為0.5-1.8 mm），AF5代表排卵前卵泡（卵泡直徑>7 mm）（圖1A）。對每個分離的卵母細胞進行scM&T-seq測序，利用單細胞亞硫酸鹽測序（scWGBS-seq）和Smart-seq2分別對分離的細胞核進行DNA甲基化和細胞質全長mRNA平行分析。轉錄組數據中，62個卵母細胞中的53個在質控后用于下游分析。平均每個卵母細胞獲得8.68Gb數據。盡管竇卵泡大小不同，但5組卵母細胞直徑和細胞質轉錄本數量（原始reads≥5）相對相似。主成分分析（PCA）顯示，卵母細胞細胞質轉錄組不根據相應卵泡大小或遺傳背景進行聚類（圖1B）。

此外，結果不受測序數據量和比對率的影響，即使對于大小相似的卵泡，細胞質轉錄組圖譜也呈現高度異質性，與此前報道一致。

不考慮相應的卵泡大小，應用scran R包中無監督聚類通過轉錄組進一步對卵母細胞進行分類。清晰的揭示出兩個主要的卵母細胞簇：I型卵母細胞（n=25）和II型卵母細胞（n=29）（圖1C）。這兩種類型的卵母細胞具有顯著不同的細胞質轉錄本數量，II型卵母細胞中平均有10418個基因，而I型卵母細胞中平均有5444個基因。與I型卵母細胞相比，II型細胞質轉錄本幾乎是I型的兩倍（圖1D）。此外，每種類型的基因方差分布分析表明，II型卵母細胞的轉錄本在單個卵母細胞之間表現出更多異質性（圖1E）。已知卵母細胞細胞類型特異性標記基因普遍表達，在新的兩種類型之間沒有差異（圖1F）。此外，與II型卵母細胞相比，I型卵母細胞中與細胞死亡和凋亡相關的基因表達水平相似或更低，表明在I型卵母細胞中觀察到的有限的基因表達不能歸因于其不健康狀態。這些觀察結果確保上述卵母細胞類型不受任何技術或不必要的生物學混雜因素驅動。

圖1：竇卵泡期，細胞質單細胞轉錄組（Smart-seq2）將豬卵母細胞分為兩類

A.        從竇形成期（AF1）到排卵前期（AF5），竇卵泡大小不同。

B.        卵母細胞細胞質轉錄組的PCA分析不根據相應的卵泡大小進行聚類。

C.        t-SNE分析（t-distributed Stochastic Neighbor Embedding）顯示基于圖的細胞質轉錄組無監督聚類，揭示卵母細胞兩個明確亞型。

D.        每個卵母細胞細胞質中的轉錄本基因數量。

E.        基因log表達在卵母細胞間的方差分布。

F.        已知的六種卵母細胞類型特異性標記基因的表達水平。

ns不顯著（p>0.05）。E/F采用Wilcoxon秩和檢驗

（2）兩種不同類型卵母細胞的染色質結構和DNA甲基化

H3K4me3和H3K27me3是哺乳動物卵母細胞生長過程中與染色質結構相關的兩個表觀遺傳標記。這兩種類型的組蛋白修飾免疫染色顯示，無論大小，竇卵泡中卵母細胞的染色質結構可能松散或緊密，即非包圍核仁(non-surrounded nucleolus, NSN)或包圍核仁(surrounded nucleolus, SN)。因此在相同大小的卵泡中卵母細胞的發育狀態在染色質凝聚方面表現出異質性。

scBS-seq分析了50個卵母細胞的DNA甲基化狀態，50個卵母細胞中有43個具有平行的細胞質轉錄組數據，包括21個I型卵母細胞和22個II型卵母細胞。平均每個卵母細胞產生44.4 Gb單細胞全基因組亞硫酸鹽測序(scWGBS)數據(150 bp reads)，平均覆蓋約11.40M(40.7%)CpG位點?？紤]到scBS-seq甲基化狀態的離散性，與常規WGBS-seq不同，作者開發了一個新的methyConcerto分析包，實現了EBMC（empirical Bayesian methylation caller）來鑒定甲基化胞嘧啶(mC)位點。由于兩個樣本對CG島(CpG island,CGI) 的mC密度平均誤差(mean absolute error，MAE) 的不同定義，作者對這43個卵母細胞進行了無監督分層聚類分析。先前的研究揭示了非嚙齒動物和嚙齒動物之間的成熟卵母細胞(FGO)甲基化模式截然不同，為進一步表征I型和II型卵母細胞的甲基化模式，首先將本研究中的DNA甲基化和RNA表達樣本合并創建“偽批量重復”(pseudo-bulk replicates)樣本，發現基因體和CGI甲基化水平以及基因表達與豬FGO高度相關(相關系數≥0.80,p<2.2e?16)。將本研究中活性(TPM≥20)和非活性(TPM< 20)基因體甲基化分布與已發表的豬FGO和MII及小鼠FGO和MII的RNA-seq和DNA甲基化數據進行比較，發現豬卵母細胞中活性和非活性基因體的甲基化水平普遍較高，而小鼠卵母細胞在(偽)批量重復和單細胞水平下的非活性基因甲基化水平較低、活性基因甲基化水平較高。這些結果表明目前數據可靠。

根據轉錄組分類的兩種類型卵母細胞的DNA甲基化水平在很大程度上不同（圖2A）。因此，作者分析了兩組卵母細胞在啟動子區、CGI、CpG島上下游2kb以內區域(CpG shore ,CpG島岸)、CpG島岸上下游2kb以內區域(CpG shelve,CpG大陸架)、基因和基因間區域（圖2B）等不同基因組區域的mCG水平。分析結果表明啟動子和基因間區外，其他區域的II型卵母細胞平均mCG水平顯著高于I型卵母細胞（Wilcoxon檢驗；p<0.05；圖2B）。此外II型卵母細胞在CGI區和啟動子區域中比I型卵母細胞表現出顯著更多的高甲基化（>0.75）區域和顯著更少的低甲基化（<0.25）。在兩種類型的卵母細胞中鑒定出1141個差異甲基化區域（differentially methylated regions, DMR），其中99.91%（1140）的DMR在II型卵母細胞中甲基化水平高于I型。1140個DMR相關基因似乎在“細胞生長正調控”、“發育性細胞生長”、PI3K-Akt信號通路、mToR信號通路和長壽調控通路中顯著富集。編碼和非編碼基因體的泛基因甲基化水平也顯示出典型但不同的模式（圖2C）。根據這一結果，II型卵母細胞細胞質中DNMT1、DNMT3A和DNMT3B轉錄本數量顯著高于I型卵母細胞（圖2D）。II型甲基化密度高于I型，II型卵母細胞的活性和非活性基因體甲基化水平高于I型，且與MII型更相似（圖2E）。將目前的基因表達和DNA甲基化數據與已發表的豬MII卵母細胞的RNA表達和DNA甲基化數據進行比較，發現II型卵母細胞與MII卵細胞更相似。因此，研究將II型卵母細胞分類為染色質結構為SN的成熟型卵母細胞，而將I型卵母細胞分類為染色質結構為NSN的未成熟型卵母細胞。

圖2：豬卵母細胞DNA甲基化譜。

A.      卵母細胞甲基化差異熱圖和分層聚類。兩組卵母細胞差異為所有CpG島甲基化水平的平均誤差(MAE)。

B.      兩組卵母細胞在不同基因組區域的mCG密度。頂部顯示兩組卵母細胞差異p值。

C.      TSS上游10Kbp至TES下游10Kbp的平均甲基化水平。兩種類型卵母細胞以及編碼基因和非編碼基因之間差異顯著

D.      編碼DNA甲基轉移酶的三個基因的Log表達水平。

E.      16號染色體基因組視圖舉例說明了I/II型卵母細胞的不同模式。重新分析了已發表的豬成熟卵母細胞(FGO)和豬MII卵母細胞的大量數據比較。

Ns不顯著(p> 0.05);*p< 0.05，**p< 0.01，***p< 0.001，以此類推；B/D采用Wilcoxon秩和檢驗

（3）II型和I型卵母細胞的差異性等位基因特異性甲基化

圖3：基因組廣泛分布的ASM CpG揭示了豬卵母細胞中親本和母本等位基因的普遍不對稱性。

A.      scBS-seq的ASM分析流程。

B.      50個卵母細胞沿50 Kbp內計算所有卵母細胞的平均ASM水平（紅點）和平均甲基化水平（藍點）。兩者之間有明顯的對應關系。

C.      兩種類型卵母細胞生物學一致的ASM CpG（BCA-CpGs）數量和基因組分布。對角線數統計了每種基因組特征中BCA-CpG數量；非對角數統計了兩種任意類型的基因組特征的BCA-CpG交集數量。

D.      BCA-CpG相關基因的KEGG基因集富集分析（在啟動子中至少5個BCA-CpGs）。部分重要基因通路（青色標記）也在差異表達基因中富集。

E.      大量BCA-CpG僅在II型卵母細胞中檢測到。

F.      利用MEME中的SEA分析（Simple Motif Analysis）對不同類型的卵母細胞的BCA-CpG 52bp序列（CpG和25bp內）的motif富集

（4）比較細胞質轉錄組學揭示了卵母細胞成熟的關鍵基因通路

圖4：豬卵母細胞的細胞質轉錄組及其與啟動子DNA甲基化的協調作用。

A.      II型卵母細胞中上調基因的KEGG富集通路分析。II型卵母細胞的轉錄增強表現出繁忙的信號通路和代謝增強成熟能力。

B.      II型卵母細胞中上調染色質修飾和RNA代謝相關基因的表達水平（歸一化z評分）。

C.      轉化Φ?1 CDF（the inverse of standard normal cumulative function）后的p值分布，檢測細胞質基因表達和啟動子甲基化之間的協調性。實際分布偏離了理論正態分布，并呈負偏態，表明部分基因的協調性。p＜0.005的基因被視為協調基因。

D.      C的負協調基因中KEGG基因集富集分析（p<0.05）

（5）GC和II型卵母細胞之間的互相交流

圖5卵泡GC75中的粒細胞與卵母細胞互相交流。

A.      竇卵泡GC75體細胞10×單細胞基因表達譜的t-SNE分析。對三種主要細胞類型進行了注釋。

B.      用于注釋細胞類型的六個典型標記的表達水平。

C.      卵母細胞scM&T-seq的細胞質轉錄組的PCA分析。卵泡GC75中的卵母細胞Oocyte75為II型。

D.      8種表皮生長因子在壁粒細胞（mGC）、丘粒細胞（cGC）和卵母細胞中的表達水平

（6）胰島素信號通路在卵母細胞成熟中起關鍵作用

圖6：體外成熟（IVM）實驗對六種胰島素信號通路相關因子的驗證。

A.   CellChat揭示的卵母細胞間DEG和參與卵母細胞-粒細胞互相交流的基因交叉ClueGO網絡富集。“卵母細胞減數分裂”與胰島素信號通路顯著相關。

B.   卵母細胞樣品的顯微照片。有能力的卵母細胞恢復分裂，并擠壓出極體（first polar body）。

C-D.   微注射45h后6個基因分別過表達（C）或敲低（D）的卵母細胞IVM成熟率。通過單Pearson卡方檢驗來檢驗與對照組的比率相等性。ns不顯著，p>0.05；*p<0.05，**p<0.01；n=卵母細胞重復

研究結論

細胞質轉錄組分析（Smart-seq2）結果顯示，II型比I型卵母細胞具有顯著更多的轉錄本，但卵母細胞的全基因組重亞硫酸鹽測序（scWGBS）分析結果表明II型卵母細胞甲基化水平顯著高于I型。II型的印跡模式是漸進的，沒有完成，GC和II型卵母細胞之間的串擾活躍，表明II型更容易成熟。通過體外成熟實驗進一步驗證了胰島素信號通路中的IRS1是卵母細胞成熟的關鍵調節因子，也為未來的單細胞甲基化組學研究提供了新的方法學平臺。

參考文獻：

Yuan X, Chen N, Feng Y, Li N, Pan X, Tian Y, Wang J, Jiang Y, He D, Li J, Gao F. Single-cell multi-omics profiling reveals key regulatory mechanisms that poise germinal vesicle oocytes for maturation in pigs. Cell Mol Life Sci. 2023 Jul 22;80(8):222.