電鏡免疫膠體金—銀法染色技術

免疫膠體金—銀染色（1mmunogold-sliverstaining）技術系20世紀80年代Holgate將免疫金染色和銀顯影方法結合而建立的一種新型檢測技術，亦可用于電鏡包埋前染色。其基本原理是*行免疫膠體金染色標記抗原，使其結合在組織細胞抗原所在位置，然后進行物理顯影，當顯影劑中的對苯二酚將銀離子還原成銀原子時，后者將圍繞金顆粒形成一個“銀殼”。“銀殼”本身亦具有催化作用，進一步促使更多銀離子還原，則使“銀殼”越來越大，抗原位置因此而變得清晰，抗原信號也得以放大，故此法是zui為敏感的細胞化學方法之一。因金顆粒的電子密度高，加之敏感性也高，故特別適合免疫電鏡的抗原研究。

主要操作程序如下：
（1）組織固定后，5％、10％和20％系列濃度的蔗糖處理，制作冰凍切片，厚10～30gm；
（2）含l％正常羊血清或1％BSA的PBS室溫孵育20分鐘，封閉抗體非特異性結合部位；
（3）含1％氫硼化鈉的PBS孵育20分鐘；
（4）*抗體孵育，可先置4~C，12～18小時，然后室溫1小時，使抗體充分滲透并結合；
（5）PBS漂洗3次，每次5分鐘；
（6）0．1％BSA／PBS液（pH 8．2）漂洗5分鐘，為膠體金結合提供堿性環境；
（7）膠體金標記的第二抗體（pH 8．2）室溫孵育30～45分鐘，需摸索*稀釋度；
（8）硝酸銀液避光處理2—10分鐘，顯影時間根據實驗結果確定；
硝酸銀液配制：雙蒸水60ml，枸櫞酸緩沖液10mi，對苯二酚1．0g溶于30ml雙蒸水，將三者混合，*溶解后，用前加入硝酸銀液2．0mi（含35mg硝酸銀）混勻；
枸櫞酸緩沖液的配制：枸櫞酸（C6H8O7H2O）25. 5g，枸櫞酸三鈉（NaC6H5O72H20）23．5g，用雙蒸水溶解至100ml，即為pH 3．5的枸櫞酸緩沖液。
（9）解剖顯微鏡下選取免疫反應陽性部位。1％Os04后固定30分鐘，雙蒸水漂洗；
（10）組織標本的脫水、樹脂包埋、超薄切片制作及電鏡觀察等方法同前述。

主要優點：該方法形成的金銀顆粒電子密度高，反差強，敏感度高；包埋前染色的標本可在解剖顯微鏡下選取陽性部位，結合半超薄切片的應用，能明顯提高工作效率，特別適于抗原含量少的組織細胞的免疫電鏡研究。缺點：顯影處理需在暗室進行，操作較繁瑣；而且增加包埋前免疫染色處理的步驟易導致非特異性著色；另外，單個金顆粒周圍結合的銀粒子不甚牢固，漂洗等處理容易脫離，半定量研究時應注意；此外銀等廢液直接流人下水道，容易導致環境污染。

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