微生物的生理生化實驗—IMViC試驗

在微生物學(xué)中，微生物的生理生化反應(yīng)的結(jié)果有兩種，第一，有機分子分解后形成了新的物質(zhì)，第二，新的物質(zhì)將不同微生物聯(lián)系在一起，或利用或抑制，也就是他們間的物質(zhì)基礎(chǔ)。

一、生理生化反應(yīng)的基礎(chǔ)

為什么不同的微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的代謝能力不同呢？比如人類吃了秸稈，不好消化，牛就可以，為什么？……

這些都基于不同生物體內(nèi)不同的酶系統(tǒng)，不同的酶系統(tǒng)對不同營養(yǎng)物質(zhì)的分解能力不同，導(dǎo)致代謝產(chǎn)物也不一致，所以，微生物的生理生化反應(yīng)也被作為細(xì)菌鑒定和分類的主要內(nèi)容之一。

二、常見生理生化試驗詳細(xì)操作步驟

常見的生理生化試驗主要有四個，主要用來快速鑒別大腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌，常合稱為IMViC試驗。

IMViC是吲哚試驗（indol test）、甲基紅試驗（methyl red test，MR試驗）、伏-波試驗（Vogen-Prokauer test，V-P試驗）和檸檬酸鹽利用試驗（citrate test）4個實驗的縮寫，其中，i是在英文中為了發(fā)音方便而加上去的。

(一) 單糖發(fā)酵試驗

1. 實驗?zāi)康模?/span>根據(jù)細(xì)菌生理生化的差異，了解細(xì)菌碳、氮源代謝類型的多樣性，掌握部分根據(jù)生理生化反應(yīng)進行細(xì)菌鑒定方法。簡單說，就是考察微生物對不同單糖的消耗情況，選擇合適的單糖。

2. 實驗原理：在培養(yǎng)基中加入一定量的溴甲酚紫指示劑和杜氏小管，不同的單糖分解后產(chǎn)生不同的產(chǎn)物，產(chǎn)物的不同會導(dǎo)致指示劑顏色發(fā)生相應(yīng)的變化。可以根據(jù)指示劑顏色的變化和小導(dǎo)管內(nèi)是否產(chǎn)氣，簡單區(qū)分不能微生物。

3. 詳細(xì)操作步驟

(1) 配制培養(yǎng)基：配制蛋白胨培養(yǎng)基，分裝到相同的試管中，并加入杜氏小管。

(2) 添加單糖：將葡萄糖、乳糖等分別加入到蛋白胨培養(yǎng)基內(nèi)，使其終濃度為10g/L。

(3) 接種：將大腸桿菌、枯草芽孢桿菌按照液體接種方法分別接種于上述培養(yǎng)基管中，標(biāo)記。

(4) 培養(yǎng)：放置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24h。

(5) 觀察結(jié)果：由于一些細(xì)菌能分解某種糖類產(chǎn)酸，所以培養(yǎng)基中pH下降至7.0以下，在溴甲酚紫指示劑的顯示下，培養(yǎng)基顏色由紫色變黃色。產(chǎn)酸者以“+”表示；如果同時產(chǎn)生氣體，則培養(yǎng)基中倒置的小管內(nèi)有氣泡出現(xiàn)，此乃產(chǎn)酸又產(chǎn)氣，以“⊕”表示；不分解，則指示劑不變色，用“-”表示。

(二) 吲哚試驗

1. 實驗?zāi)康模?/span>吲哚實驗是一種常見的生理生化實驗，通常用于檢查某種有機物質(zhì)中是否存在芳香族化合物。

2. 實驗原理：某些細(xì)菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水培養(yǎng)基中的色氨酸，產(chǎn)生吲哚（靛基質(zhì)），再與吲哚試驗（對二甲基氨基苯甲醛）反應(yīng)，形成紅色化合物玫瑰吲哚，即為陽性反應(yīng)。

3. 實驗詳細(xì)操作步驟

(1) 配制培養(yǎng)基：配制蛋白胨培養(yǎng)基，分裝到相同的試管中，并加入杜氏小管。參照“杜氏小管產(chǎn)氣”試驗相關(guān)內(nèi)容。

(2) 接種：將大腸桿菌、枯草芽孢桿菌按照液體接種方法分別接種于上述培養(yǎng)基試管管中，標(biāo)記。

(3) 培養(yǎng)：放置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18-24h后，在兩支試管中分別滴加10-20滴乙mi，震蕩數(shù)次后靜置3min。

(4) 添加吲哚試劑：每管沿管壁緩緩加入3-5滴吲哚試劑于培養(yǎng)液面上，待1-2min后觀察。

(5) 結(jié)果顯示：在交界面出現(xiàn)玫瑰紅色環(huán)即為吲哚試驗陽性（+），無紅色環(huán)即為陰性（-）。

(三) 甲基紅試驗

1. 實驗?zāi)康?/strong>：用于檢測和鑒別腸道細(xì)菌的發(fā)酵能力，特別是大腸埃希菌和產(chǎn)氣腸桿菌的鑒別。

2. 實驗原理：某些細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，繼而分解為甲酸、乙酸、乳酸等，使培養(yǎng)基pH降至4.2以下，加入甲基紅指示劑呈紅色，此為陽性反應(yīng)（+）；若產(chǎn)酸量少或產(chǎn)生的酸進一步轉(zhuǎn)化為醇、醛、氣體和水等，則培養(yǎng)基的pH仍為6.2以上，加入甲基紅指示劑呈黃色，此為陰性反應(yīng)（-）。

3. 詳細(xì)操作步驟

(1) 分別將大腸桿菌和枯草芽孢桿菌接種于兩支葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中。

(2) 放置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18-24h，取出，分別滴加2-3滴甲基紅試劑，混勻，觀察結(jié)果。

(3) 結(jié)果顯示：

(四) 伏-波試驗

1.實驗?zāi)康?/strong>：主要用于鑒別某些能發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸的細(xì)菌，特別是那些能夠產(chǎn)生大量丙酮酸的細(xì)菌?。

2. 實驗原理：有些細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸進行縮合，脫羧生成乙酰甲基甲醇，在堿性環(huán)境中被氧化為二乙酰，再與培養(yǎng)基內(nèi)精氨酸的胍基結(jié)合，生成紅色化合物，則為伏-波試驗陽性（+）。

3. 詳細(xì)實驗步驟

(1) 分別將大腸桿菌和枯草芽孢桿菌接種于兩支葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中。

(2) 放置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18-24h，取出試管后倒掉一半培養(yǎng)液，然后分別加入氫氧化鉀水溶液5-10滴和等體積的α-奈酚乙醇溶液，搖勻，37℃水浴鍋水浴15-30min。

(3) 觀察結(jié)果：培養(yǎng)液變?yōu)榧t色為陽性（+），黃色為陰性（-）。

(五) 檸檬酸鹽利用實驗

1.實驗?zāi)康模?/strong>主要用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒定?。

2. 實驗原理：檸檬酸鹽為唯yi碳源，磷酸銨為唯yi氮源，細(xì)菌分解培養(yǎng)基中的檸檬酸鹽、磷酸銨后產(chǎn)生堿性化合物，使培養(yǎng)基pH升高。因此，可根據(jù)能否利用檸檬酸鹽來鑒別細(xì)菌。如細(xì)菌可利用檸檬酸鹽作為碳源，細(xì)菌生長繁殖形成菌苔，分解檸檬酸鹽生成堿性碳酸鹽，使培養(yǎng)基pH上升到7.0以上，麝香草酚藍(lán)指示劑由綠色變?yōu)樯钏{(lán)色，為檸檬酸鹽利用試驗陽性(+)；如細(xì)菌不能分解檸檬酸鹽，則培養(yǎng)基顏色不發(fā)生變化，為檸檬酸鹽利用試驗陰性(-)。

3. 詳細(xì)實驗步驟

(1) 配制培養(yǎng)基：

(2) 接種：分別將大腸桿菌和枯草芽孢桿菌接種于兩支檸檬酸鹽斜面培養(yǎng)基中。

(3) 培養(yǎng)：放置于37℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)18-24h后，觀察結(jié)果。

(4) 預(yù)期結(jié)果:

大腸桿菌：-（無菌苔生長，培養(yǎng)基不變色）。
枯草芽孢桿菌：+（有菌苔生長，培養(yǎng)基變色）。

(六) 淀粉利用實驗

1. 實驗?zāi)康?/strong>：主要用于鑒別微生物對淀粉的利用能力。

2. 實驗原理：微生物對大分子物質(zhì)如淀粉不能直接利用，必須依靠產(chǎn)生的胞外酶將大分子物質(zhì)分解，才能被微生物吸收利用。有些細(xì)菌有合成淀粉酶的能力，可以分泌胞外淀粉酶，淀粉酶可水解淀粉為麥芽糖和葡萄糖，淀粉水解后遇碘不再變藍(lán)色。

3. 實驗步驟

(1) 配制淀粉培養(yǎng)基：

(2) 接種：分別接種大腸桿菌、枯草芽孢桿菌至淀粉固體培養(yǎng)基上，標(biāo)記，注意接種長度盡量相等。

(3) 培養(yǎng)：放置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18-24h后觀察細(xì)菌的生長情況，

(4) 添加碘液：滴入少量魯氏碘液，輕輕旋轉(zhuǎn)平板使碘液均勻鋪滿整個平板。

(5) 觀察結(jié)果：如菌苔周圍出現(xiàn)無色透明圈，說明淀粉被水解，為陽性（+）；透明圈的大小反應(yīng)細(xì)菌水解淀粉能力的強弱。

4. 預(yù)期結(jié)果：大腸桿菌：-，枯草芽孢桿菌：+。

三、注意事項

1. 該實驗內(nèi)容中所涉及菌種是作為生理生化反應(yīng)的對比菌種，重點注意避免發(fā)生交叉污染和標(biāo)記錯亂的現(xiàn)象。

2. 使用酒精燈時需要特別注意操作安全。

3. 70%乙醇、乙mi等化學(xué)試劑可以燃燒，需要遠(yuǎn)離明火。

4. 單糖發(fā)酵試驗部分，在接種后需要注意請緩搖動試管時避免氣泡進入倒置小管中。

5. 吲哚試驗部分，乙mi萃取過程一定要充分和靜置，再沿管壁滴加吲哚試劑以避免破壞已分層界面。

文章來源：環(huán)凱（）轉(zhuǎn)載于“ 微生物知識庫 ”公眾號；原作者~發(fā)酵菌人。
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