IPS誘導腸類器官培養(yǎng)攻略（第三階段）

IPS誘導腸類器官培養(yǎng)分為三大階段：人多能干細胞的培養(yǎng)、內(nèi)胚層分化及中/后腸模式化誘導、類器官培養(yǎng)。

類器官培養(yǎng)（14-28天）

原代

一、準備工作

試劑耗材

人正常腸類器官培養(yǎng)試劑盒(abs9545)，基質(zhì)膠（低因子、無酚紅）(abs9495)，15ml離心管(abs7102)，1.5ml EP管若干(abs7119)，24孔細胞培養(yǎng)板(abs7035)、金屬冰盒。

二、操作流程

1、加膠-點板-加液（這里是整個原代操作的點睛之筆）

（1）準備工作

a 基質(zhì)膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過夜融化；

b 槍頭、離心管需要-20℃提前預冷至少半小時；

c 融化后的基質(zhì)膠可一直放4℃儲存，建議2周內(nèi)用完。

低溫金屬冰盒（abs7289）

（2）接種要求

24孔板(abs7035)，每孔25ul基質(zhì)膠球狀體混合物，500-750uL類器官培養(yǎng)基。

（3）接種密度

密度建議1：基質(zhì)膠總體積：球狀體總體積=25:1（如果估摸細胞團沉淀體積困難，通常加300uL基質(zhì)膠足夠）

密度建議2：50個球狀體/25uL基質(zhì)膠（如果想計數(shù)接種，可以參照此密度建議）

（4）加膠-點板

向細胞團沉淀加入基質(zhì)膠(abs9495)，進行吹打混勻（不要滿吹滿打，容易產(chǎn)生氣泡），然后進行點板。整個操作在金屬冰盒或冰上進行。操作熟練以后，加膠，混勻，點板控制在半分鐘內(nèi)，有利于保持基質(zhì)膠良好的流暢性。

（5）加液

將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中40-60min成膠，添加500-750μl類器官培養(yǎng)基A進行培養(yǎng)。大概10-14天，多數(shù)類器官直徑在200um-500um，可進行傳代操作。

鋪板密度

小腸類器官生長圖

傳代（消化分兩種情況）

一、類器官數(shù)量較多或體積較大傳代步驟

1、類器官收集及洗滌

1）收集：移液器吸去培養(yǎng)基，每孔添加1-2ml左右4℃類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G，輕柔吹散基質(zhì)膠，收集在15ml離心管中(24孔板，每5孔為一組)。

2）洗滌：加類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G定容至14ml（緩沖液越多，基質(zhì)膠被稀釋的越充分，越容易去除），4℃靜置 40min或-20℃放置5min（目的是使基質(zhì)膠軟化，如果冰箱保溫效果強，縮短冷凍時間，摸索合適的冷凍時間時，可取出離心管搖晃看不到基質(zhì)膠說明冷化好了）。

3）接下來將離心管進行300g，4℃， 離心5min，離心完通常會有這兩種情況：

第一種是正常情況，分成三層（如下圖），此時棄掉上清和基質(zhì)膠層，保留類器官沉淀即可。

第二種是不正常情況，分成兩層（如下圖），這種情況可能與冷化不充分有關。此時棄掉緩沖液，留下基質(zhì)膠類器官混懸液，重復上一步洗滌步驟，再次冷化離心，通常能出現(xiàn)清晰分層（緩沖液層、基質(zhì)膠層、類器官沉淀層），此時棄掉上清和基質(zhì)膠層，保留類器官沉淀即可。如果依然是兩層（緩沖液層和基質(zhì)膠類器官混懸液層），此時棄掉緩沖液和上1/3的基質(zhì)膠類器官混懸液，保留下2/3即可。

促進基質(zhì)膠和類器官有效分離條件：

a離心機的選擇非常重要，水平角離心機相比固定角離心機更利于基質(zhì)膠和類器官分離；

b離心機的溫度最好是4℃（可避免基質(zhì)膠固化），離心轉速可適當提高（最高不要超過500g），離心時間可適當加長（最常不超過10min）。

2、類器官消化

1）添加2-3mL類器官傳代消化液D于超凈臺內(nèi)消化2-3min，消化期間吹打1-2次。此步驟以消化成細胞團為主，千萬不要消化成單細胞，單細胞類器官存活率低。如果不確定是否消化適宜，可吸取數(shù)微升鏡下觀察，如果有較多細胞團可停止消化。

2）添加5倍類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G（緩沖液：消化液=5:1）終止消化，300g 4℃ 離心 5min 棄去上清（如果有基質(zhì)膠殘留，殘留量<50ul正常，不影響傳代類器官增殖）

3、加膠-點板-加液

（1）準備工作

a 基質(zhì)膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過夜融化；

b 槍頭、離心管需要-20℃提前預冷至少半小時；

c 融化后的基質(zhì)膠可一直放4℃儲存，建議2周內(nèi)用完。

（2）接種要求

24孔板(abs7035)，每孔25ul基質(zhì)膠細胞團混合物，500-750uL類器官培養(yǎng)液。

（3）接種密度

密度建議1： 類器官通常按1:2傳代，例如，24孔板收集5孔，傳代10孔，需要的基質(zhì)膠量25*10=250ul

密度建議2：500個細胞團/25uL基質(zhì)膠（如果想計數(shù)接種，可以參照此密度建議）

注意：不管是按密度建議1還是，密度建議2，如果有殘留的基質(zhì)膠，新膠量至少是殘留膠量的1.5倍

（4）加膠-點板

向細胞團沉淀加入基質(zhì)膠(abs9495)，進行吹打混勻（不要滿吹滿打，容易產(chǎn)生氣泡），然后進行點板。整個操作在金屬冰盒或冰上進行。操作熟練以后，加膠，混勻，點板控制在半分鐘內(nèi)，有利于保持基質(zhì)膠良好的流暢性。

（5）加液

將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中40-60min成膠，添加500-750μl人腸癌類器官培養(yǎng)基 A進行培養(yǎng)。大概10-14天，多數(shù)類器官直徑在200-300um，可進行傳代操作。

二、類器官數(shù)量不足或體積較小時：

1、類器官收集、吹打、洗滌

1）移液器吸去培養(yǎng)基，每孔添加 1-2ml 左右4℃類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G，輕柔吹散基質(zhì)膠。

2）進行吹打，將類器官吹成細胞團（可取樣鏡下觀察有較多細胞團時可停止吹打）；

3）洗滌： 24孔板，每5孔為一組，收集在 15ml 離心管中，加類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G定容至14ml（緩沖液越多，基質(zhì)膠被稀釋的越充分，越容易去除），4℃靜置 40min或-20℃放置5min（目的是使基質(zhì)膠軟化，如果冰箱保溫效果強，縮短冷凍時間，摸索合適的冷凍時間時，可取出離心管搖晃看不到基質(zhì)膠說明冷化好了）。

4）接下來將離心管進行300g，4℃， 離心5min，離心完通常會有這兩種情況：

第一種是正常情況，分成三層（如下圖），此時棄掉上清和基質(zhì)膠層，保留細胞團沉淀即可。

第二種是不正常情況，分成兩層（如下圖），這種情況可能與冷化不充分有關。此時棄掉緩沖液，留下基質(zhì)膠類器官混懸液，重復上一步洗滌步驟，再次冷化離心，通常能出現(xiàn)清晰分層（緩沖液層、基質(zhì)膠層、類器官沉淀層），此時棄掉上清和基質(zhì)膠層，保留類器官沉淀即可。如果依然是兩層（緩沖液層和基質(zhì)膠細胞團混懸液層），此時棄掉緩沖液和上1/3的基質(zhì)膠細胞團混懸液，保留下2/3即可。

促進基質(zhì)膠和類器官有效分離條件：

a 離心機的選擇非常重要，水平角離心機相比固定角離心機更利于基質(zhì)膠和類器官分離；

b 離心機的溫度最好是4℃（可避免基質(zhì)膠固化），離心轉速可適當提高（最高不要超過500g），離心時間可適當加長（最常不超過10min）。

2、加膠-點板-加液

（1）準備工作

a 基質(zhì)膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過夜融化；

b 槍頭、離心管需要-20℃提前預冷至少半小時；

c 融化后的基質(zhì)膠可一直放4℃儲存，建議2周內(nèi)用完。

（2）接種要求

24孔板(abs7035)，每孔25ul基質(zhì)膠細胞團混合物，500-750uL類器官培養(yǎng)液

（3）接種密度

密度建議1： 對于類器官數(shù)量較少的情況，為了維持生長所需的旁分泌信號，需要2-3孔富集到1孔，例如，24孔板收集6孔，2孔富集1孔，鋪3孔，需要的基質(zhì)膠量25*3=75uL

密度建議2：500個細胞團/25uL基質(zhì)膠（如果想計數(shù)接種，可以參照此密度建議）

注意：不管是按密度建議1還是按密度建議2，如果有殘留的基質(zhì)膠，新膠量至少是殘留膠量的1.5倍

（4）加膠-點板

向細胞團沉淀加入基質(zhì)膠(abs9495)，進行吹打混勻（不要滿吹滿打，容易產(chǎn)生氣泡），然后進行點板。整個操作在金屬冰盒或冰上進行。操作熟練以后，加膠，混勻，點板控制在半分鐘內(nèi)，有利于保持基質(zhì)膠良好的流暢性。

（5）加液

將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中40-60min成膠，添加500-750μl類器官培養(yǎng)基 A進行培養(yǎng)。大概7-10天，多數(shù)類器官直徑在200-300um，可進行再次傳代。

凍存

凍存要領:

類器官不需要消化（消化后的類器官復蘇活率低）；

在類器官指數(shù)增長期凍存（等到該傳代的時候類器官活性比指數(shù)期差），也就傳代后的Day3-Day4，多數(shù)類器官直徑在100um-200um，這個時機選擇凍存。

一、類器官收集及洗滌

1、收集：移液器吸去培養(yǎng)基，每孔添加 1-2ml 左右4℃類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G，輕柔吹散基質(zhì)膠，收集在 15ml 離心管中(24孔板，每5孔為一組)。

2、洗滌：加類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G定容至14ml（緩沖液越多，基質(zhì)膠被稀釋的越充分，越容易去除），4℃靜置 40min或-20℃放置5min（目的是使基質(zhì)膠軟化，如果冰箱保溫效果強，縮短冷凍時間，摸索合適的冷凍時間時，可取出離心管搖晃看不到基質(zhì)膠說明冷化好了）。

3、接下來將離心管進行300g，4℃， 離心5min，離心完通常會有這兩種情況：

第一種是正常情況，分成三層（如下圖），此時棄掉上清和基質(zhì)膠層，保留類器官沉淀即可。

第二種是不正常情況，分成兩層（如下圖），這種情況可能與冷化不充分有關。此時棄掉緩沖液，留下基質(zhì)膠類器官混懸液，重復上一步洗滌步驟，再次冷化離心，通常能出現(xiàn)清晰分層（緩沖液層、基質(zhì)膠層、類器官沉淀層），此時棄掉上清和基質(zhì)膠層，保留類器官沉淀即可。如果依然是兩層（緩沖液層和基質(zhì)膠類器官混懸液層），此時棄掉緩沖液和上1/3的基質(zhì)膠類器官混懸液，保留下2/3即可。

促進基質(zhì)膠和類器官有效分離條件：

a 離心機的選擇非常重要，水平角離心機相比固定角離心機更利于基質(zhì)膠和類器官分離；

b 離心機的溫度最好是4℃（可避免基質(zhì)膠固化），離心轉速可適當提高（最高不要超過500g），離心時間可適當加長（最常不超過10min）。

二、類器官凍存

1、凍存密度，以24孔板為例

密度建議1：2孔/mL 凍存液

密度建議2：500個類器官/mL 凍存液（如果想計數(shù)凍存，可以參照此密度建議）

2、添加適量類器官凍存液 F，輕柔吹打重懸，建議立即進行凍存。（放置太久，DMSO對類器官有損傷）

3、梯度凍存：將凍存管放入梯度凍存盒然后保存至-80℃過夜，第二天取出放入液氮罐。

     手動凍存：4℃冰箱放置30 min，轉移至-20℃放置1h，然后移至-80℃過夜，第二天取出放入液氮罐。

復蘇

一、實驗前準備

1、將水浴鍋預熱至37℃；

2、細胞實驗室進行常規(guī)消毒，用預防噴霧噴涂并且使用紫外線照射40min的超凈工作臺臺面；

3、在超凈工作臺中按次序擺好消過毒的離心管、吸管、培養(yǎng)板等。

二、取出凍存管

1、根據(jù)類器官凍存記錄按標簽找到所需類器官的編號。

2、從液氮罐中取出凍存盒，取出所需的凍存管，同時核對凍存管外的編號。

三、迅速解凍

1、迅速將凍存管投入到已經(jīng)預熱的水浴鍋中解凍，并要不斷地搖動，使管中地液體迅速融化。

2、約1-2min后凍存管內(nèi)液體wan全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管地外壁，再拿入超凈臺內(nèi)。

四、將類器官凍存液移入15ml離心管，添加10倍體積類器官傳代培養(yǎng)緩沖液 G（緩沖液體積：凍存液體積=10:1）重懸，輕柔吹打混勻，300g 4℃ 離心 5min，棄上清。

五、加膠-點板-加液

1、準備工作

（1）基質(zhì)膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過夜融化

（2）槍頭、離心管需要-20℃提前預冷至少半小時

（3）融化后的基質(zhì)膠可一直放4℃儲存，建議2周內(nèi)用完

2、復蘇要求

24孔板（abs7035），每孔25ul基質(zhì)膠類器官混合物，500-750uL類器官培養(yǎng)液

3、復蘇密度

復蘇密度建議1：1:1接種（原來凍幾孔就復蘇幾孔）

復蘇密度建議2：250個類器官/25uL基質(zhì)膠（如果想計數(shù)接種，可以參照此密度建議）

4、加膠-點板

向類器官沉淀加入基質(zhì)膠（abs9495），進行吹打混勻（不要滿吹滿打，容易產(chǎn)生氣泡），然后進行點板。整個操作在金屬冰盒或冰上進行。操作熟練以后，加膠，混勻，點板控制在半分鐘內(nèi)，有利于保持基質(zhì)膠良好的流暢性。

5、加液

將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中40-60min成膠，添加500-750μl類器官培養(yǎng)基 A進行培養(yǎng)。大概10-14天，多數(shù)類器官直徑在200um-500um，可進行傳代操作。

關鍵注意事項

1、Matrigel操作：全程冰上操作，避免提前固化。  

2、密度控制：內(nèi)胚層分化前細胞需達85-90%融合，否則影響球狀體形成。 

3、生長因子活性：使用新鮮配制或分裝保存的因子，避免反復凍融。 

4、污染防控：無菌操作，定期檢測支原體。  

常見問題與解決（Troubleshooting）

通過嚴格遵循上述步驟并優(yōu)化細節(jié)，可高效生成功能性人類腸道類器官，適用于疾病建模、藥物篩選等研究。

今天講解就到這了，大家如有實驗問題，歡迎一起交流哦！

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