LNP促進mRNA在眼部前房的遞送與基因表達和編輯

來源：邁安納（上海）儀器科技有限公司 2025年03月20日 14:48

眼部前段疾病是全球導致視力損害和失明的主要原因之一，其中白內障、青光眼和視網膜疾病尤為突出。這些疾病嚴重影響患者的生活質量，且治療手段有限。近年來，基因治療作為一種新興的治療方法，在眼部疾病治療中展現(xiàn)出巨大潛力。脂質納米顆粒作為非病毒載體，具有高效、安全、生物相容性好等優(yōu)點，在眼部基因治療中受到廣泛關注。本研究旨在探索LNP介導的mRNA遞送在眼部前房基因表達和編輯中的應用，為眼部前段疾病的治療提供新的思路。

脂質納米顆粒（LNPs）在視網膜疾病的基因治療領域顯示出巨大潛力。本研究旨在擴展LNP的應用，探索通過前房內注射（IC）途徑將LNP介導的mRNA遞送至眼部前房，以實現(xiàn)基因表達和編輯。研究結果顯示，IC注射LNP可促進蛋白表達和基因編輯，且未觀察到眼部毒性，表明IC注射LNP的安全性。本研究為LNP在眼部前房疾病治療中的應用提供了有力證據(jù)。

圖一、示意圖

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材料與方法

LNP制備：采用離子化脂質、輔助脂質、膽固醇和聚乙二醇化脂質制備LNP，封裝mRNA。
動物模型：選用Ai9小鼠和C57BL/6小鼠作為實驗動物。
前房內注射：通過顯微注射技術將LNP注射至小鼠眼部前房。
基因表達和編輯檢測：采用熒光顯微鏡、免疫組化和高通量測序等技術檢測基因表達和編輯效率。

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結果

2.1 LNP的制備與表征：

本研究中，我們使用微流控混合法制備了封裝有Cre-重組酶mRNA、mCherry mRNA或Cas9 mRNA-sgRNA的LNP。LNP的制備包括將mRNA溶于檸檬酸鹽緩沖液（pH 4.0）作為水相，而將LP01/DSPC/膽固醇/DMG-PEG2k溶于乙醇作為有機相，摩爾比為50/10/38.5/1.5。制備的LNP用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）稀釋后用于注射。LNP的表征顯示其粒徑均勻，封裝效率高，且穩(wěn)定性良好，為后續(xù)的體內實驗提供了基礎。

圖二、LNP的表征

2.2 LNP在前房的mRNA遞送與蛋白表達：

為了評估LNP在前房的轉染效果，我們首先使用封裝有Cre-mRNA的LNP對Ai9小鼠進行IC注射。Ai9小鼠是一種報告基因小鼠，其基因組中整合了loxP位點兩側的tdTomato基因，當Cre酶存在時，loxP位點間的序列會被切除，從而激活tdTomato基因的表達。結果顯示，IC注射后1周，通過共聚焦顯微鏡觀察到角膜內皮和虹膜角膜角處出現(xiàn)強烈的tdTomato熒光信號，表明Cre-mRNA成功遞送并被翻譯成Cre酶，進而實現(xiàn)了基因重組。

隨后，我們使用封裝有mCherry-mRNA的LNP對C57BL/6小鼠進行IC注射，以評估LNP在前房組織的蛋白表達情況。mCherry是一種紅色熒光蛋白，其表達依賴于mCherry mRNA的攝取和翻譯。結果顯示，注射后72小時，虹膜角膜角處的小梁網（TM）組織出現(xiàn)強烈的mCherry熒光信號，且該信號在注射后120小時內逐漸減弱。這一結果表明，LNP能夠選擇性地將mRNA遞送至TM組織，并實現(xiàn)局部蛋白表達。

圖三、TdTomato在虹膜角膜角的表達（由Cre LNP轉染后）

圖四、LNP介導的mCherry在虹膜角膜角的表達

2.3 LNP介導的基因編輯：

最后，我們制備了封裝有Cas9 mRNA和sgAi9 guide RNA的LNP，以探索在前房組織中的基因編輯效果。sgAi9是一種針對Ai9小鼠中floxed-stop密碼子的sgRNA，能夠引導Cas9酶切割該位點，從而激活tdTomato基因的表達。結果顯示，IC注射后，通過共聚焦顯微鏡觀察到虹膜角膜角處出現(xiàn)強烈的tdTomato熒光信號，且該信號隨著注射劑量的增加而增強。這表明Cas9-sgAi9 LNP成功遞送并被翻譯成Cas9酶和sgRNA，進而實現(xiàn)了基因編輯。

圖五、Cas9-sgAi9 LNP注射后虹膜角膜角的基因編輯

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討論

本研究成功證明了LNP介導的mRNA遞送在眼部前房基因表達和編輯中的應用潛力。LNP作為非病毒載體，具有高效、安全、生物相容性好等優(yōu)點，在眼部基因治療中展現(xiàn)出巨大優(yōu)勢。通過前房內注射途徑，LNP能夠直接將mRNA遞送至目標組織，實現(xiàn)局部高濃度的藥物暴露，從而提高治療效果。此外，LNP還具有良好的生物屏障穿透能力，能夠克服眼部組織對藥物的吸收障礙。然而，本研究仍存在一些局限性。例如，LNP在體內的分布和代謝機制尚不充分清楚，需要進一步深入研究。此外，雖然本研究未觀察到眼部毒性，但長期安全性仍需進一步評估。

參考文獻：Vasudevan, Aishwarya, et al. "Lipid nanoparticle-mediated intracameral mRNA delivery facilitates gene expression and editing in the anterior chamber of the eye." Journal of Controlled Release 379 (2025): 1022-1028.

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