賽默飛Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑應(yīng)用全攻略：從入門(mén)到精通

賽默飛Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑（貨號(hào)11668019）應(yīng)用全攻略：從入門(mén)到精通

一、產(chǎn)品核心優(yōu)勢(shì)與應(yīng)用場(chǎng)景

Lipofectamine 2000是賽默飛世爾推出的明星級(jí)陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，廣泛用于DNA/RNA的哺乳動(dòng)物細(xì)胞遞送。其核心優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在：

· 高轉(zhuǎn)染效率：適用于貼壁細(xì)胞（HEK293、HeLa）和懸浮細(xì)胞（CHO、Jurkat），DNA轉(zhuǎn)染效率可達(dá)85%-95%（數(shù)據(jù)來(lái)源：Thermo Fisher Protocol）

· 低細(xì)胞毒性：通過(guò)優(yōu)化脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)，48小時(shí)培養(yǎng)后細(xì)胞存活率≥90%

· 多場(chǎng)景適配：支持質(zhì)粒DNA、siRNA、miRNA及CRISPR/Cas9系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染

二、標(biāo)準(zhǔn)化操作流程（以24孔板為例）

1. 試劑準(zhǔn)備

· 稀釋DNA：需保持無(wú)菌環(huán)境，推薦使用Opti-MEM培養(yǎng)基（貨號(hào)31985070）將DNA稀釋至0.5-2 μg/μL

· 脂質(zhì)體混合：Lipofectamine 2000與稀釋液比例為1:25（如：1 μL試劑+24 μL培養(yǎng)基）

2. 復(fù)合物形成

· 將脂質(zhì)體稀釋液與DNA稀釋液按1:1體積混合

· 關(guān)鍵步驟：室溫靜置20分鐘，形成穩(wěn)定脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物（時(shí)間偏差＞5分鐘會(huì)導(dǎo)致效率下降10%-15%）

3. 細(xì)胞處理

· 貼壁細(xì)胞需達(dá)到70%-80%融合度

· 每孔加入100 μL復(fù)合物，37℃孵育6小時(shí)后換液

三、針對(duì)不同細(xì)胞類(lèi)型的優(yōu)化策略

四、三大常見(jiàn)問(wèn)題解決方案

1. 轉(zhuǎn)染效率低

· 排查方向：DNA純度（OD260/280需在1.8-2.0）、細(xì)胞狀態(tài)（傳代次數(shù)≤15）

· 優(yōu)化方案：添加增強(qiáng)劑（如PlasmidPlus，貨號(hào)A31852）

2. 細(xì)胞毒性顯著

· 原因分析：脂質(zhì)體過(guò)量或孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)

· 改進(jìn)措施：將轉(zhuǎn)染時(shí)間縮短至4小時(shí)，DNA濃度降低30%

3. RNA干擾效率不佳

· 技術(shù)要點(diǎn)：siRNA終濃度控制在20-50 nM，推薦使用Silencer Select系列（貨號(hào)4392420）

· 驗(yàn)證方法：設(shè)置Cy3標(biāo)記siRNA對(duì)照組，熒光顯微鏡觀察攝取效率

五、高階應(yīng)用：CRISPR遞送實(shí)例

Protocol亮點(diǎn)：

· Cas9質(zhì)粒與sgRNA質(zhì)量比采用1:3（如 1 μg : 3 μg）

· 共轉(zhuǎn)染熒光報(bào)告系統(tǒng)（如pEGFP-N1，貨號(hào)6085-1）

· 使用流式細(xì)胞術(shù)篩選后，基因編輯效率提升40%（參考文獻(xiàn)：Nat Methods 2016）

六、保存與質(zhì)量控制

存儲(chǔ)條件：4℃避光保存，避免反復(fù)凍融（凍融超3次活性下降50%）

有效期驗(yàn)證：開(kāi)封后6個(gè)月內(nèi)使用，每月進(jìn)行轉(zhuǎn)染陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)

質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)：每批次均通過(guò)HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染測(cè)試，EGFP表達(dá)率≥85%

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