碘化丙啶（PI）：細胞活力分析與死細胞檢測的熒光探針

在細胞生物學研究中，準確區分活細胞和死細胞對于許多實驗至關重要。碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）作為一種常用的細胞核熒光染料，以其工作機制和廣泛應用成為細胞活力分析的得力工具。

一、PI 的染色原理與特性

PI 是一種溴化乙錠（EB）的類似物，能夠嵌入雙鏈 DNA 的堿基對之間。當 PI 與 DNA 結合后，會在 488 nm 的激發光下產生熒光，最大發射波長為 617 nm。PI 無法穿透活細胞的完整細胞膜，因此不能對活細胞進行染色。然而，對于死細胞或細胞膜受損的細胞，PI 可以自由進入細胞并與 DNA 結合，發出明亮的紅色熒光。這一特性使得 PI 成為檢測死細胞的理想選擇。

PI 的熒光信號強度與細胞內 DNA 的含量成正比，這意味著它可以用于定量分析細胞內的 DNA 含量。此外，PI 的熒光信號穩定，不易受到光漂白的影響，這使得它在長時間的觀察和檢測中表現出色。

二、PI 在細胞活力分析中的應用

PI 廣泛應用于細胞活力分析和死細胞檢測。在細胞凋亡研究中，PI 可用于區分活細胞和死細胞。凋亡細胞的細胞膜完整性受到破壞，PI 可以進入細胞并與 DNA 結合，產生紅色熒光。而活細胞的細胞膜保持完整，PI 無法進入，因此不產生熒光。通過熒光顯微鏡或流式細胞儀檢測 PI 熒光信號，可以準確地評估細胞的存活率和死亡率。

PI 與 Calcein-AM 等活細胞熒光探針結合使用時，可以實現對活細胞和死細胞的雙重染色。Calcein-AM 標記活細胞產生綠色熒光，PI 標記死細胞產生紅色熒光。這種雙重染色方法在熒光顯微鏡下可以清晰地顯示活細胞和死細胞的分布情況，為細胞毒性檢測、藥物篩選和細胞生物學研究提供了有力支持。

三、PI 的操作使用方法

染色前準備

在進行 PI 染色之前，需要準備好細胞樣本。對于貼壁細胞，可以使用胰蛋白酶消化收集細胞，然后用適當的緩沖液洗滌細胞，去除殘留的培養基成分。對于懸浮細胞，直接收集細胞并進行洗滌。將細胞調整到合適的濃度，一般為 1×10^5 - 1×10^6 cells/mL，以便于后續的染色和檢測。

染色過程

將準備好的細胞與 PI 染色液混合，PI 的常用工作濃度為 1 - 10 μg/mL。將混合后的細胞懸液置于室溫下避光孵育 10 - 30 分鐘。在孵育過程中，PI 會進入死細胞并與 DNA 結合，產生紅色熒光。

染色后處理

孵育完成后，對于某些實驗，可能需要去除未進入細胞的 PI，以減少背景熒光。可以使用適當的緩沖液對細胞進行洗滌，但需注意操作輕柔，避免細胞損失。將處理后的細胞懸液或細胞涂片置于熒光顯微鏡下觀察。在熒光顯微鏡下，死細胞會發出明亮的紅色熒光，而活細胞則不顯示熒光。對于流式細胞儀檢測，將染色后的細胞懸浮在適當的緩沖液中，通過設置 488 nm 的激發波長和 617 nm 左右的發射波長檢測通道，收集紅色熒光信號，實現對死細胞的定量分析。

四、PI 的應用案例與研究成果

PI 已被廣泛應用于多種研究領域。在細胞凋亡研究中，科研人員利用 PI 染色結合流式細胞儀分析，評估了多種細胞類型在不同刺激下的凋亡率。在細胞毒性檢測中，PI 與 Calcein-AM 雙重染色方法被用于檢測化合物對細胞的毒性作用，為藥物研發提供了重要數據支持。在細胞周期分析中，PI 可用于染色細胞核 DNA，通過流式細胞儀分析細胞周期各階段的 DNA 含量分布，揭示細胞周期調控機制。

此外，PI 還被用于細胞核形態學研究。通過熒光顯微鏡觀察 PI 染色后的細胞核形態變化，研究人員可以分析細胞在不同生理和病理條件下的核變化特征。由于 PI 的熒光信號可以在 488 nm 激發下產生，它還可以與 FITC 和 PE 等其他熒光染料聯合使用，實現多重熒光標記實驗，為復雜生物過程的研究提供了更全面的視角。