單克隆抗體 N-糖基化的毛細管電泳和質 譜分析

前言近年來，單克隆抗體 (mAb) 已成為生物制藥行業具有潛力的新興蛋白候選藥物。其藥物研發流程包括一系列精細的控制和評估步驟，需要仔細、嚴格地監測目標化合物的治療穩定性及有效性。因此，在商業化前的每個階段對 mAb 進行全面表征是極其有益的。在大量研究成熟的蛋白翻譯后修飾中，已知糖基化在很多生物過程中都扮演著重要的角色（例如蛋白降解和轉錄），從而影響健康和疾病進展1。而鑒定重要蛋白分子中連接的糖基則需要一種可靠、穩定、靈敏的分析技術。近來，毛細管電泳 (CE) 在糖蛋白分析領域得到了眾多關注，主要是由于其可以縮短分析時間，并保持高效分離。使用一種熒光發色團（ATPS，陰離子）對酶解所得多糖進行標記，CE 分離后，利用高靈敏度的激光誘導熒光 (LIF) 或質譜 (MS)進行檢測。APTS 標記將負電荷傳遞給多糖，可提高電泳分離能力，并使之更適用于電噴霧電離（負模式），使整個分離和檢測過程與熒光標記化學高度兼容。將CE 與 MS 串聯有益于鑒定未知的糖基化修飾或質量信息，并進行峰指認2。本應用簡報展示了利用 CE-QTOF MS 對重組 mAb 所得的 N-糖基進行分析。APTS 標記的 CE-MS 方法有助于鑒定 mAb 上的所有糖基。此外，還可得到每種多糖的相對百分比，以表征主要及次要糖基化修飾。

前言近年來，單克隆抗體 (mAb) 已成為生物制藥行業具有潛力的新興蛋白候選藥物。其藥物研發流程包括一系列精細的控制和評估步驟，需要仔細、嚴格地監測目標化合物的治療穩定性及有效性。因此，在商業化前的每個階段對 mAb 進行全面表征是極其有益的。在大量研究成熟的蛋白翻譯后修飾中，已知糖基化在很多生物過程中都扮演著重要的角色（例如蛋白降解和轉錄），從而影響健康和疾病進展1。而鑒定重要蛋白分子中連接的糖基則需要一種可靠、穩定、靈敏的分析技術。近來，毛細管電泳 (CE) 在糖蛋白分析領域得到了眾多關注，主要是由于其可以縮短分析時間，并保持高效分離。使用一種熒光發色團（ATPS，陰離子）對酶解所得多糖進行標記，CE 分離后，利用高靈敏度的激光誘導熒光 (LIF) 或質譜 (MS)進行檢測。APTS 標記將負電荷傳遞給多糖，可提高電泳分離能力，并使之更適用于電噴霧電離（負模式），使整個分離和檢測過程與熒光標記化學高度兼容。將CE 與 MS 串聯有益于鑒定未知的糖基化修飾或質量信息，并進行峰指認2。本應用簡報展示了利用 CE-QTOF MS 對重組 mAb 所得的 N-糖基進行分析。APTS 標記的 CE-MS 方法有助于鑒定 mAb 上的所有糖基。此外，還可得到每種多糖的相對百分比，以表征主要及次要糖基化修飾。

CE-MS 儀器方法CE-ESI-MS 分析中使用 7100 CE 系統（配有CE-MS毛細管卡套，部件號 G1603A），串聯 6520 精確質量 Q-TOF（配有雙離子源及正交共軸鞘液接口，部件號 G1607B）3。使用空緩沖液和標準品優化分離條件和噴霧穩定性。鞘液 CE-MS 接口處維持一個較低的流速 (5 µL/min) 以保持 CE 分離的高效性，并為電噴霧電離提供一個穩定流及其它必要的噴霧條件。Q-TOF 參數由MS 調諧系統自動優化，并利用 ESI 調諧混合物對 MS 系統進行校正。

表 1 列出了 CE-MS 的參數。所有化合物列表由 MassHunter 分子特征提取 (MFE)算法提取所得。

結果與討論盡管 CE-LIF 常用于多糖分析，但 CE-MS能提供分子量信息，所以在鑒定電泳結果中的未知遷移條帶方面具有優勢。在本應用簡報中，將 CE 與配有鞘液接口的 Q-TOF MS 串聯，以指認 mAb 所得多糖的質量信息。方案 1 描述了 mAb 糖譜的 CE-MS 分析步驟。簡單地說，抗體釋放的多糖先進行 APTS 標記，然后進行 CE-MS 分析。圖 1 為重組 mAb 中釋放所得的 N-糖基的 CE-MS 總化合物譜。利用 PVA 涂層毛細管，所有 mAb 多糖均可在 15 分鐘分離時間內實現遷移。通過重復實驗，我們成功鑒定了未帶電荷的N-糖基類化合物，包括 G0、G0F、G1、G1F、G2 和 G2F。此外，還觀察到了單唾液酸化的多糖 G2F+1NANA。所有峰的指認均基于 Q-TOF 分析測得的精確分子量。

表 2 總結了本研究中鑒定的多糖。需要注意的是，在 CE-MS 分析中成功鑒定出 G2類，但 LC/MS 分析中并未鑒定出（數據未列出），表明基于 CE-MS 的分析有顯著優勢（即 CE-MS 的互補價值）。

表 2 總結了本研究中鑒定的多糖。需要注意的是，在 CE-MS 分析中成功鑒定出 G2類，但 LC/MS 分析中并未鑒定出（數據未列出），表明基于 CE-MS 的分析有顯著優勢（即 CE-MS 的互補價值）。

表 2 總結了本研究中鑒定的多糖。需要注意的是，在 CE-MS 分析中成功鑒定出 G2類，但 LC/MS 分析中并未鑒定出（數據未列出），表明基于 CE-MS 的分析有顯著優勢（即 CE-MS 的互補價值）。

很敏感。通過計算相對于總化合物峰容量的百分容量，可對 mAb 釋放所得的多糖進行相對定量，結果如表 2 所示。在本例中，G2+1NANA 是糖型中的主要形式。

這些結果清晰地指出 CE-MS 可成為檢測糖譜的一種有效的替代分析工具。串聯CE-MS 分離可避免污染，這是因為樣品處理步驟很少，CE 分離使用的緩沖液與電噴霧電離高度兼容。與 CE-LIF 相比，該方法在糖譜分析中更為靈敏、精確。

結論本應用簡報提供了一個基于 Agilent CE-MS的 mAb糖譜分析方法。Agilent MassHunter和 BioConfirm 軟件包的強大數據處理能力能夠成功、詳盡地鑒定并得出 mAb 糖型譜。此外，通過分離主要和次要多糖形式，可合理解析糖基化模式。