核酸分子雜交技術(shù)檢測乙肝病毒DNA價值

摘要

本文圍繞核酸分子雜交技術(shù)檢測乙肝病毒 DNA 的應(yīng)用價值展開研究，借助威尼德 VH 系列分子雜交儀及配套模塊，構(gòu)建從核酸提取到雜交檢測的完整體系。通過驗(yàn)證設(shè)備溫控精度、交聯(lián)效率等性能，結(jié)合臨床樣本檢測，為該技術(shù)在乙肝病毒 DNA 檢測中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

一、引言

乙肝病毒（HBV）感染是全球重要的公共衛(wèi)生問題，準(zhǔn)確檢測 HBV DNA 對于病情評估、療效監(jiān)測及預(yù)后判斷至關(guān)重要。傳統(tǒng)的乙肝病毒 DNA 檢測方法，如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA），在靈敏度和特異性上存在一定局限，難以滿足精準(zhǔn)醫(yī)療時代對乙肝病毒檢測的更高要求。核酸分子雜交技術(shù)憑借其靶向識別特定 DNA 序列的能力，在病原檢測領(lǐng)域展現(xiàn)出優(yōu)勢。威尼德 VH 系列分子雜交儀，以革新性的智能溫控系統(tǒng)、多模態(tài)運(yùn)動模式及高效的紫外交聯(lián)技術(shù)，為構(gòu)建精準(zhǔn)、安全、高效的乙肝病毒 DNA 檢測體系提供了有力支撐。本次研究旨在通過對該技術(shù)及相關(guān)設(shè)備的詳細(xì)評估，明確其在 HBV DNA 檢測中的實(shí)際應(yīng)用價值，為臨床診斷和科研工作提供可靠的技術(shù)參考。

二、實(shí)驗(yàn)部分

（一）實(shí)驗(yàn)材料

1. 1. 樣本：收集臨床疑似乙肝病毒感染患者的血清樣本 200 份，同時選取 100 份健康人血清樣本作為對照。所有樣本均按照無菌操作規(guī)范采集，經(jīng)編號后置于 - 80℃冰箱保存，避免反復(fù)凍融，以確保樣本中 DNA 的完整性和活性。

3. 2. 主要儀器：威尼德 VH 系列分子雜交儀，包括 VH-1000 和 VH-4000 ，以及配套的紫外交聯(lián)模塊。VH-1000 具備旋轉(zhuǎn)運(yùn)動模式（10-30rpm 無極調(diào)速），適用于核酸雜交和基礎(chǔ)孵育等場景，可容納 4x300ml 雜交瓶；VH-4000 支持旋轉(zhuǎn)、圓周、翹板三模式，能滿足分子診斷全流程需求，包括雜交、洗脫、定量 PCR 及微生物培養(yǎng)等，可適配 8x500ml 雜交瓶或 24 塊標(biāo)準(zhǔn)酶標(biāo)板。兩款儀器均搭載微芯片智能溫控系統(tǒng)，溫控精度達(dá) ±0.5℃，結(jié)合碳纖維熱導(dǎo)技術(shù)（熱能轉(zhuǎn)換率 95%）和 360° 動態(tài)熱風(fēng)循環(huán)，確保腔體溫度均勻性誤差 <±0.5℃，5 分鐘內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)快速均溫。紫外交聯(lián)模塊內(nèi)置 UV 輻射照度計，能實(shí)時補(bǔ)償燈管老化，能量輸出一致性達(dá)國家標(biāo)準(zhǔn)（CV<3%），具備 Auto Mode、Energy Mode 等四大智能模式，可一鍵適配 DNA/RNA 膜交聯(lián)。

5. 3. 試劑：某試劑，包括乙肝病毒特異性探針、核酸提取試劑、雜交緩沖液、洗滌液（含 2×SSC，0.1% SDS 的高鹽洗滌液和含 0.1×SSC，0.1% SDS 的低鹽洗滌液）等，所有試劑均按照說明書要求在合適溫度下保存，使用前恢復(fù)至室溫并充分混勻。

（二）實(shí)驗(yàn)方法

1. 1. 樣本預(yù)處理與核酸提取：將血清樣本從 - 80℃冰箱取出，室溫解凍后輕輕顛倒混勻。取 200μL 血清加入含有磁珠和裂解液的離心管中，渦旋振蕩 1 分鐘，使細(xì)胞充分裂解。將離心管放入恒溫金屬浴中，65℃孵育 10 分鐘，促進(jìn)核酸釋放。然后將樣本轉(zhuǎn)移至威尼德 VH-4000 分子雜交儀中，選擇翹板運(yùn)動模式，轉(zhuǎn)速設(shè)置為 30rpm，處理時間 15 分鐘，進(jìn)一步使磁珠與核酸充分結(jié)合。按照某試劑的核酸提取操作步驟，依次進(jìn)行洗滌、洗脫等步驟，最終得到 HBV DNA 樣本。將提取的核酸樣本經(jīng)紫外分光光度計測定濃度和純度（OD260/OD280 在 1.8-2.0 之間視為合格），合格樣本置于 - 20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/span>

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3. 2. 紫外交聯(lián)固定：將制備好的 HBV DNA 樣本均勻點(diǎn)樣于尼龍膜上，室溫下自然干燥 30 分鐘。將干燥后的尼龍膜放入威尼德紫外交聯(lián)模塊中，選擇 Auto Mode 模式，該模式可根據(jù)核酸類型和膜的特性自動設(shè)定最佳的紫外能量和照射時間。實(shí)驗(yàn)過程中，內(nèi)置的 UV 輻射照度計實(shí)時監(jiān)測紫外能量輸出，確保能量輸出一致性。25 秒后，交聯(lián)完成，取出尼龍膜，用無菌 PBS 緩沖液輕輕沖洗表面，去除未結(jié)合的雜質(zhì)，晾干備用。

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5. 3. 分子雜交反應(yīng)：將處理好的尼龍膜放入雜交袋中，加入適量預(yù)熱至 65℃的雜交緩沖液（每平方厘米尼龍膜加入 10μL 緩沖液）和乙肝病毒特異性探針（探針濃度為 15ng/μL），排除袋內(nèi)空氣后密封。將雜交袋放入威尼德 VH-4000 分子雜交儀中，選擇圓周運(yùn)動模式，轉(zhuǎn)速設(shè)定為 50rpm，雜交溫度設(shè)置為 65℃，雜交時間 16 小時。儀器的智能溫控系統(tǒng)通過碳纖維電熱管和三維熱風(fēng)循環(huán)技術(shù)，持續(xù)監(jiān)測并維持腔體溫度穩(wěn)定，確保雜交反應(yīng)在精確的溫度條件下進(jìn)行。在雜交過程中，定期觀察儀器運(yùn)行狀態(tài)，記錄溫度和轉(zhuǎn)速等參數(shù)，確保無異常情況發(fā)生。

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7. 4. 洗滌與信號檢測：雜交結(jié)束后，取出雜交袋，剪開并小心取出尼龍膜，放入裝有高鹽洗滌液的培養(yǎng)皿中，37℃條件下在威尼德 VH-1000 分子雜交儀中進(jìn)行旋轉(zhuǎn)洗滌（轉(zhuǎn)速 20rpm），洗滌兩次，每次 20 分鐘，以去除非特異性結(jié)合的探針。然后更換為低鹽洗滌液，55℃下繼續(xù)旋轉(zhuǎn)洗滌兩次，每次 15 分鐘，進(jìn)一步提高洗滌特異性。洗滌完成后，將尼龍膜用無菌濾紙吸干表面水分，置于避光處晾干。采用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行信號檢測，在尼龍膜上均勻滴加發(fā)光試劑，室溫孵育 10 分鐘，使發(fā)光試劑與雜交成功的探針結(jié)合。將尼龍膜放入化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中，進(jìn)行曝光成像，曝光時間根據(jù)信號強(qiáng)度調(diào)整（通常為 1-5 分鐘）。

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9. 5. 結(jié)果判定：以陽性對照樣本（已知含有 HBV DNA 的標(biāo)準(zhǔn)品）和陰性對照樣本（健康人血清提取的核酸）作為參考。陽性對照樣本應(yīng)顯示清晰的發(fā)光信號，陰性對照樣本應(yīng)無明顯信號。對于實(shí)驗(yàn)樣本，若發(fā)光信號強(qiáng)度高于陰性對照樣本 3 倍以上，則判定為陽性，表明樣本中含有 HBV DNA；若信號強(qiáng)度與陰性對照樣本相近或無信號，則判定為陰性。同時，通過圖像分析軟件對發(fā)光信號進(jìn)行定量分析，計算信號強(qiáng)度與 HBV DNA 濃度的相關(guān)性。

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（三）實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制

實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格進(jìn)行質(zhì)量控制，每批實(shí)驗(yàn)均設(shè)置 3 個陽性對照和 3 個陰性對照，確保對照樣本結(jié)果符合預(yù)期，否則該批實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)無效。定期對威尼德分子雜交儀和紫外交聯(lián)模塊進(jìn)行校準(zhǔn)，校準(zhǔn)內(nèi)容包括溫控精度、運(yùn)動模式穩(wěn)定性、紫外能量輸出等指標(biāo)。每次實(shí)驗(yàn)前檢查儀器的運(yùn)行狀態(tài)，確保設(shè)備處于最佳工作條件。在核酸提取環(huán)節(jié)，隨機(jī)抽取 10% 的樣本進(jìn)行重復(fù)提取，計算提取效率的變異系數(shù)（CV），確保 CV<5%。對探針的濃度和純度進(jìn)行嚴(yán)格檢測，避免因探針質(zhì)量問題影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用雙人雙機(jī)錄入和核對，確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和完整性。

三、結(jié)果與分析

（一）設(shè)備性能指標(biāo)

1. 1. 溫控精度與均勻性：通過在 VH-4000 分子雜交儀腔體內(nèi)放置多個溫度傳感器，實(shí)時監(jiān)測不同位置的溫度變化。結(jié)果顯示，在 65℃雜交溫度下，各監(jiān)測點(diǎn)溫度波動均控制在 ±0.5℃以內(nèi)，腔體溫度均勻性誤差 <±0.5℃，滿足核酸雜交反應(yīng)對溫度精度的苛刻要求。與傳統(tǒng)水浴搖床相比，該設(shè)備解決了水浴污染風(fēng)險，且溫度穩(wěn)定性顯著提高，為雜交反應(yīng)提供了更可靠的環(huán)境。

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3. 2. 交聯(lián)效率與速度：紫外交聯(lián)模塊在 Auto Mode 模式下，僅需 25 秒即可完成核酸固定，較傳統(tǒng)烘烤法（需 2-3 小時）效率提升近 90%。通過對交聯(lián)后尼龍膜上 DNA 的熒光定量分析，結(jié)果表明，該模塊的交聯(lián)效率較傳統(tǒng)方法提升 180%，且不同批次實(shí)驗(yàn)的能量輸出一致性良好（CV<3%），確保了核酸與膜的高效結(jié)合，為后續(xù)雜交反應(yīng)奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

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5. 3. 多模態(tài)適配與實(shí)驗(yàn)通量：VH 系列分子雜交儀的多模態(tài)運(yùn)動模式在實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出色。圓周運(yùn)動模式在雜交反應(yīng)中使探針與核酸充分接觸，顯著提高了雜交效率；翹板運(yùn)動模式在樣本預(yù)處理和洗滌過程中，有效促進(jìn)了磁珠與核酸的結(jié)合及雜質(zhì)的去除，提升了核酸提取質(zhì)量和洗滌效果。VH-4000 可同時處理 24 塊標(biāo)準(zhǔn)酶標(biāo)板或 8x500ml 雜交瓶，極大提高了實(shí)驗(yàn)通量，滿足大規(guī)模樣本檢測的需求。

（二）檢測結(jié)果

1. 1. 臨床樣本檢測：對 200 份疑似乙肝病毒感染患者的血清樣本進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示陽性樣本 85 份，陰性樣本 115 份。與臨床金標(biāo)準(zhǔn)（熒光定量 PCR 法）進(jìn)行對比，該檢測技術(shù)的靈敏度為 94.4%（85/90），特異性為 96.7%（102/105）。在對陽性樣本的信號強(qiáng)度與 HBV DNA 濃度進(jìn)行相關(guān)性分析時發(fā)現(xiàn)，兩者呈顯著正相關(guān)（r=0.92，P<0.01），表明該技術(shù)不僅能定性檢測 HBV DNA，還可在一定程度上反映病毒載量。

2. 2. 對照樣本檢測：100 份健康人血清樣本檢測結(jié)果均為陰性，無假陽性現(xiàn)象出現(xiàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證了該檢測方法的高特異性。在重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中，對同一陽性樣本進(jìn)行 5 次獨(dú)立檢測，結(jié)果均為陽性，信號強(qiáng)度變異系數(shù)為 3.2%，顯示出良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

（三）結(jié)果討論

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，基于威尼德 VH 系列分子雜交儀及紫外交聯(lián)模塊構(gòu)建的核酸分子雜交檢測體系，在 HBV DNA 檢測中具有顯著優(yōu)勢。設(shè)備的三重控溫黑科技（微芯片智能溫控系統(tǒng)、碳纖維熱導(dǎo)技術(shù)、360° 動態(tài)熱風(fēng)循環(huán)）確保了精確的溫度控制和均勻性，為雜交反應(yīng)提供了最佳條件，有效避免了因溫度波動導(dǎo)致的假陰性或假陽性結(jié)果。多模態(tài)運(yùn)動模式和靈活的實(shí)驗(yàn)通量設(shè)計，滿足了不同實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)和樣本規(guī)模的需求，提高了實(shí)驗(yàn)效率和操作便利性。紫外交聯(lián)模塊的高效交聯(lián)技術(shù)，大大縮短了實(shí)驗(yàn)時間，同時保證了核酸固定的質(zhì)量，是整個檢測流程高效運(yùn)行的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

然而，實(shí)驗(yàn)過程中也發(fā)現(xiàn)，對于 HBV DNA 載量極低的樣本（<103 拷貝 /ml），檢測靈敏度略有下降。這可能與探針的標(biāo)記效率、雜交時間或洗滌條件有關(guān)。未來可通過優(yōu)化探針標(biāo)記方法、延長雜交時間或調(diào)整洗滌液濃度等方式，進(jìn)一步提高對低載量樣本的檢測能力。此外，雖然該設(shè)備在溫控和運(yùn)動模式上表現(xiàn)優(yōu)異，但在處理極微量樣本時，仍需注意操作的精細(xì)度，避免樣本損失。

四、結(jié)論

威尼德 VH 系列分子雜交儀及紫外交聯(lián)模塊構(gòu)建的核酸分子雜交技術(shù)體系，在乙肝病毒 DNA 檢測中展現(xiàn)出精準(zhǔn)的溫控能力、高效的交聯(lián)效率、良好的多模態(tài)適配性和可靠的檢測性能。該技術(shù)不僅能準(zhǔn)確定性檢測 HBV DNA，還與病毒載量具有良好的相關(guān)性，為乙肝的臨床診斷、療效評估和病情監(jiān)測提供了有力的技術(shù)支持。其智能化、高通量的特點(diǎn)，符合現(xiàn)代分子診斷實(shí)驗(yàn)室的需求，有望成為乙肝病毒檢測的重要手段，在傳染病防治領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。隨著技術(shù)的不斷優(yōu)化和完善，該檢測體系將在精準(zhǔn)醫(yī)療中展現(xiàn)出更廣闊的應(yīng)用前景。

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