成骨細胞分化培養基的背景與應用及相關研究！

一、背景

成骨細胞分化培養基是專門為正常人類成骨細胞體外培養設計的其生長的培養基。是經滅菌的液體培養基，包含必需和非必需氨基酸、維生素、有機和無機化合物、激素、生長因子、微量礦物質和低濃度胎牛血清(5%)。該培養基緩沖體系為重碳酸鹽，在含5%CO2的細胞培養箱中平衡后pH值為7.4。該培養基的配方能夠選擇性的促進正常人類微血管內皮細胞體外培養中的增殖和生長，并為其達到營養平衡狀態。

成骨細胞(osteoblast，OB)主要由內外骨膜和骨髓中基質內的間充質始祖細胞分化而來，能特異性分泌多種生物活性物質，調節并影響骨的形成和重建過程。

在不同成熟時期，成骨細胞在體內表現為4種不同形態，即前成骨細胞(preosteoblast)、成骨細胞(osteoblast)、骨細胞(osteocyte)和隊形細胞(bonesliningcell)。前成骨細胞是成骨細胞的前體，由基質干細胞分化，沿著成骨細胞譜系發育而成，位于覆蓋骨形成表面的成骨細胞的外側。成熟的成骨細胞是位于骨表面的單層細胞，承擔著合成骨基質的重要功能。

骨細胞是在成骨細胞系譜中成熟和的分化細胞。骨細胞包埋于礦化骨組織中，淺表骨細胞仍然保留部分成骨細胞結構。隊形細胞是排列于成體大部分骨表面的一層形態扁平或呈長方形的細胞。活躍的成骨細胞為梭形、錐形或立方形，胞漿嗜堿性。細胞核位于細胞的一端，核仁明顯，表面有短的突起與相鄰細胞連接。電鏡下胞漿內具有典型的蛋白合成結構——豐富的粗面內質網及核糖體，高爾基體較發達。

二、應用

成骨細胞分化培養基可以用于MKRN1通過增強PPARγ泛素化降解促進MC3T3-E1細胞成骨分化的研究：

探索E3泛素連接酶MKRN1在MC3T3-E1細胞成骨分化過程中的作用,為骨質疏松類疾病的治療提供新的方案和依據。

研究方法：

1、MKRN1對MC3T3-E1細胞成骨分化的影響RT-qPCR和Western Blot檢測MC3T3-E1細胞成骨分化過程中MKRN1 mRNA和蛋白表達量與時間的相關性。構建腺病毒載體感染MC3T3-E1細胞過表達或敲低MKRN1,成骨分化誘導后檢測ALP活性;RT-qPCR、Western Blot檢測Runx2、Co L1A1、OCN的表達水平;茜素紅染色檢測礦化結節形成情況。

2、MKRN1和PPARγ共同作用對MC3T3-E1細胞成骨分化的影響腺病毒載體感染MC3T3-E1細胞,敲低MKRN1與PPARγ的表達后誘導細胞成骨分化,檢測ALP活性;RT-qPCR、Western Blot檢測Runx2、Co L1A1、OCN的表達水平;茜素紅染色檢測礦化結節形成情況。

3、MKRN1對MC3T3-E1細胞中PPARγ表達的影響Western Blot檢測過表達或敲低MKRN1對細胞內PPARγ蛋白表達水平的影響;Co-IP檢測MC3T3-E1細胞內源性MKRN1和PPARγ結合情況;Co-IP檢測過表達MKRN1后細胞內PPARγ蛋白的泛素化水平;Western Blot檢測添加MG132后,過表達MKRN1對于細胞內PPARγ表達情況的影響。

結果：

1、MC3T3-E1細胞成骨分化過程中,MKRN1 mRNA和蛋白的表達水平隨著分化時間延長而升高;腺病毒載體能夠穩定轉染MC3T3-E1細胞,實現MKRN1過表達或敲低;敲低MKRN1表達后,與空白對照組和陰性轉染組相比較,ALP活性,Runx2、COL1A1和OCN mRNA和蛋白的表達均顯著降低,礦化結節形成減少(P<0.05);MKRN1過表達的MC3T3-E1細胞ALP活性,Runx2、COL1A1和OCN mRNA及蛋白表達量及礦化結節形成均高于空白對照組和空載轉染組(P<0.05)。

2、腺病毒載體能夠穩定轉染MC3T3-E1細胞,干擾PPARγ的表達;干擾MC3T3-E1細胞中PPARγ的表達,可以逆轉MKRN1敲低后對細胞成骨分化和礦化功能的抑制作用。

3、MC3T3-E1細胞成骨分化顯著降低PPARγ蛋白表達水平;敲低MKRN1表達后PPARγ蛋白表達水平升高,而過表達MKRN1降低了PPARγ蛋白表達(P<0.01);Co-IP證實了內源性MKRN1和PPARγ在細胞中具有相互作用;MKRN1過表達提高了PPARγ的泛素化水平;加入MG132逆轉了過表達MKRN1對PPARγ表達的抑制作用。

結論：

1、E3泛素連接酶MKRN1促進MC3T3-E1細胞的成骨向分化。

2、在MC3T3-E1細胞成骨分化過程中,MKRN1通過增強PPARγ泛素化降解發揮功能。

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