研究背景

基于研究發現的肝臟 - 腦 - 腸神經反射弧對維持腸道免疫穩態起著關鍵作用，特別是其對腸道調節性 T 細胞（pTreg 細胞）生成和維持的影響，本研究方案旨在進一步深入探究該軸在腸道免疫調控中的具體機制。通過構建類器官模型并結合 Kirkstall Quasi Vivo 類器官串聯芯片動態灌流系統，模擬體內復雜的生理環境，以更精準地揭示肝 - 腦 - 腸軸相互作用及其在腸道免疫中的功能。

研究目的

構建肝臟、腦干和腸道類器官，并成功將其整合至 Kirkstall Quasi Vivo 類器官串聯芯片動態灌流系統中，模擬體內肝 - 腦 - 腸軸的生理結構和功能聯系。

研究肝臟 - 腦 - 腸神經反射弧對腸道 APCs（抗原呈遞細胞）及 pTreg 細胞分化、增殖及功能的影響機制。 探索該軸在腸道炎癥發生發展過程中的作用，為開發針對腸道免疫相關疾病的新型治療策略提供理論依據和實驗支持。

一、 類器官構建與芯片整合

1. 類器官模塊選擇

1.1 肝臟模塊：

- 來源：人iPSC分化的肝類器官（含Kupffer細胞）

- 功能：感知腸道來源代謝物（如SCFAs、LPS），激活迷走神經傳入

1.2 腸道模塊：

- 來源：結腸類器官（含CX3CR1?巨噬細胞/CD103? DCs）

- 功能：維持pTreg細胞生態位，表達ALDH/視黃酸

1.3 神經模塊：

- 來源：人iPSC分化的迷走神經節類器官 + 腸神經元

- 功能：傳遞肝-腦干（NTS）-迷走傳出-腸神經信號

2. 多器官芯片連接設計

Kirkstall Quasi Vivo 類器官串聯芯片動態灌流系統搭建：將構建好的肝臟、腦干和腸道類器官分別植入 Kirkstall Quasi Vivo 系統的相應芯片中，通過精確的管道連接和灌流設置，模擬體內血液循環和組織間液流動，使三個類器官在動態的微環境中相互連接和作用。優化灌流參數，如流速、流量等，確保類器官之間的物質交換和信號傳遞接近體內真實生理狀態。

二、 關鍵實驗干預

1. 神經通路模擬

- 激活組：在肝臟模塊添加腸道代謝物（丁酸鹽/LPS），誘導迷走神經激活

- 抑制組：

- 肝迷走神經切斷（HVx模擬）：物理阻斷肝-神經模塊連接

- 藥理學阻斷：添加毒蕈堿受體拮抗劑（如阿托品）

2. 免疫應答檢測

- 腸道模塊輸出：

- pTreg細胞比例（流式檢測：CD4?FoxP3?RORγt?）

- APC的ALDH活性（Aldefluor染色）

- 視黃酸合成量（HPLC-MS檢測）

三、 動態灌流參數

四、實驗檢測指標

4.1 細胞水平檢測

• 采用流式細胞術分析腸道類器官中 pTreg 細胞的比例、數量及其表面標志物的表達情況；同時檢測腸道 APCs（包括樹突狀細胞、巨噬細胞等）的亞群組成、活化狀態以及醛脫氫酶（ALDH）表達水平和視黃酸合成能力等指標，評估肝 - 腦 - 腸軸對腸道免疫細胞的調控作用。

• 利用免疫熒光染色和共聚焦顯微鏡觀察類器官間神經元與免疫細胞的相互作用情況，如神經纖維與腸道 APCs 的接觸部位、信號傳遞相關蛋白的表達等，從細胞層面揭示肝 - 腦 - 腸軸的免疫調節機制。

4.2 分子水平檢測

• 通過實時熒光定量 PCR（qPCR）檢測相關基因的表達變化，包括神經系統相關基因（如神經遞質受體、離子通道等）、免疫相關細胞因子（如 TGF-β、IL-10、IL-17 等）以及 pTreg 細胞分化和功能相關基因（如 Foxp3、RORγt 等）。分析肝 - 腦 - 腸軸在不同實驗條件下對這些基因表達的調控作用，探討其潛在的分子機制。

• 運用 Western blot 技術檢測類器官中關鍵蛋白的表達水平和修飾狀態，如神經遞質受體蛋白、信號通路相關蛋白（如 pERK1/2 等）以及免疫相關蛋白（如免疫球蛋白、細胞粘附分子等）。通過蛋白表達的定量分析，進一步明確肝 - 腦 - 腸軸在細胞信號轉導和免疫調控中的作用途徑。

4.3 功能水平檢測

• 評估腸道類器官的屏障功能，如通過檢測腸道上皮細胞層的通透性（使用熒光標記的大分子物質進行透性實驗）、緊密連接蛋白的表達等指標，了解肝 - 腦 - 腸軸對腸道屏障完整性的影響，以及在腸道炎癥發生過程中該軸如何調節腸道屏障功能以維持腸道內環境穩態。

• 進行體外免疫細胞功能實驗，如將腸道 APCs 與 T 細胞共培養，檢測 T 細胞的增殖、分化和細胞因子分泌情況，分析肝 - 腦 - 腸軸對 APCs 免疫功能的調節作用以及其對 T 細胞免疫應答的影響；同時開展 pTreg 細胞抑制功能實驗，評價肝 - 腦 - 腸軸調節的 pTreg 細胞在抑制腸道炎癥反應中的作用效果。

五、數據分析與統計方法

使用專業的數據分析軟件對實驗獲得的數據進行統計學分析。對于多組間均數比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），若組間方差不齊則采用非參數檢驗方法；兩組間均數比較則使用獨立樣本 t 檢驗；相關性分析采用 Pearson 相關性檢驗或 Spearman 秩相關檢驗。以 P < 0.05 為差異有統計學意義的標準，所有數據以均數 ± 標準誤（Mean ± SEM）表示。通過對實驗數據的系統分析，深入挖掘肝 - 腦 - 腸軸在腸道免疫調控中的作用機制和潛在規律。

六、預期結果

6.1 成功構建并整合肝臟、腦干和腸道類器官至 Kirkstall Quasi Vivo 類器官串聯芯片動態灌流系統，該系統能夠模擬體內肝 - 腦 - 腸軸的生理結構和功能聯系，為研究三者之間的相互作用提供一個穩定、可靠的體外模型。

6.2 在正常生理狀態下，肝 - 腦 - 腸軸通過神經信號傳導維持腸道 APCs 的正常功能和 pTreg 細胞的穩態水平；當神經通路被阻斷時，腸道 APCs 的 ALDH 表達和視黃酸合成能力下降，pTreg 細胞數量減少，腸道免疫穩態遭到破壞，表現出類似炎癥性腸病的免疫失衡特征。

6.3 在腸道炎癥模型中，肝 - 腦 - 腸軸的神經反射活動增強，試圖通過調節腸道 APCs 和 pTreg 細胞來緩解腸道炎癥反應。而通過藥物干預調節該軸的功能（如激活或抑制特定神經遞質受體），可以有效改善腸道炎癥癥狀，增加 pTreg 細胞數量，增強其免疫抑制功能，從而為治療腸道炎癥性疾病提供新的潛在治療靶點和策略。

6.4 本研究將深化對肝 - 腦 - 腸軸在腸道免疫調控中作用機制的認識，為開發基于神經 - 免疫調節的新型治療策略提供關鍵實驗依據和理論支持。通過Kirkstall Quasi Vivo類器官串聯芯片動態灌流系統模擬體內復雜的生理環境，不僅有助于更精確地研究細胞間的相互作用和信號傳遞，還為未來的個性化醫療和藥物研發提供了創新的研究平臺和工具。

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