原代細胞提取——取材、分離、培養、純化！

百歐博偉生物：細胞實驗是科學研究中較為常見的實驗，其中原代細胞以其和反映體內生長特性的特點，在細胞實驗中被廣泛應用。

那么，什么是原代細胞？

原代細胞是指來源于胚胎、組織器官及外周血，經特殊分離方法制備而來的原初培養的細胞。初代培養物次傳代培養后的細胞，即稱之為細胞系。原代細胞的提取主要包括取材、分離、培養、純化，本次將主要介紹原代細胞的取材與分離。

取材：取材是原代細胞提取的步，也是原代細胞培養成功的首要條件。取材前需要注意組織類型、分化程度、年齡等；注意避免機械損傷，去除無用組織，同時避免干燥，最重要的是要嚴格控制無菌。另外，整個取材過程，在保證無菌的條件下，盡量快速完成，以保證樣本的新鮮和細胞活性。血液、骨髓、羊水等取材，不僅要嚴格控制無菌，還需要注意抗凝。

分離：取材完成后，需要盡快采用適當的方法將細胞分離出來。

一、懸浮細胞的分離

將取材得到的血液、羊水、胸水或腹水等進行低速離心，1000r/min，5-10min；收集細胞沉淀，用PBS（不含鈣、鎂）洗兩次，再用培養基洗一次，最后用培養基重懸細胞，調整細胞濃度后分瓶培養。若想要提取的細胞不在沉淀中，而是在細胞懸液中，則需要加入細胞分層液，經離心后，由于各種細胞的比重不同可在分層液中形成不同層，從而分離出細胞。

二、實體組織中細胞的分離

1、機械分散法

首先用剪刀和吸管將組織剪切并吹打分散細胞，然后將已充分剪碎分散的組織放在注射器內使細胞通過針頭壓出，最后在不銹鋼網內用鈍物擠壓將細胞從網孔中壓擠出。

這種分離細胞的方法簡便、快速，適合纖維成分少的軟，部分胚胎組織等，但對組織機械損傷大，而且細胞分散效果差。

2、消化分離法

這個方法就是將組織剪切成小塊，再利用酶（胰蛋白酶和/或膠原酶）的生化作用和/或非酶（EDTA）的化學作用進一步使細胞間的橋連結構松動，使團塊膨松，由塊狀變成絮狀，再結合機械法（用吸管吹打分散或電磁攪拌）使細胞團塊得以較充分的分散，制成細胞懸液。

酶或非酶的選擇需要根據組織及細胞的特性進行選擇。一般來講，胰蛋白酶適合用于消化軟組織，膠原酶適合消化纖維較多的組織，而EDTA則對上皮組織分散效果較好。另外，也可以將EDTA與胰蛋白酶以1:1或1:2的比例混合使用，這樣不僅利于細胞脫壁又利于細胞分散，可降低胰蛋白酶的用量和毒性作用。

這種方法還需要注意的是，組織塊需要使用PBS（不含鈣、鎂）漂洗2-3次以去除組織中的鈣、鎂離子和血清對胰蛋白酶和EDTA的抑制作用；同時，胰酶濃度不宜過高，作用時間不能太長，以免過量損傷細胞；消化后的組織要盡量輕柔地棄去消化液。

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