貼壁細(xì)胞培養(yǎng)中常見問題原因分析及對應(yīng)的解決方法！

百歐博偉生物：貼壁細(xì)胞在培養(yǎng)時要貼附于培養(yǎng)（瓶）器皿壁上，細(xì)胞一經(jīng)貼壁就迅速鋪展，然后開始有絲分裂，并很快進(jìn)入對數(shù)生長期。貼壁細(xì)胞因其培養(yǎng)過程較為繁瑣，所以培養(yǎng)時更容易出現(xiàn)問題。小編今天總結(jié)了貼壁細(xì)胞培養(yǎng)中常見問題，并詳細(xì)介紹原因和解決方法，若培養(yǎng)時遇到這些情況，可參考對應(yīng)解決方法處理。

一、貼壁細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞不貼壁

常見原因：胰蛋白酶消化過度；支原體污染；培養(yǎng)基pH值過堿（NaHCO3分解）；細(xì)胞老化；接種細(xì)胞起始濃度太低或太高。

解決方法：縮短胰蛋白酶消化時間或降低胰蛋白酶濃度；分離培養(yǎng)物，檢測支原體。清潔支架或培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物；使用無菌醋酸溶液調(diào)整pH值或充入無菌CO2；啟用新的保種細(xì)胞；調(diào)節(jié)接種細(xì)胞濃度。

二、培養(yǎng)細(xì)胞生長緩慢

常見原因：由于更換不同培養(yǎng)液或血清；培養(yǎng)液中一些細(xì)胞生長必須成分如谷氨酰胺或生長因子耗盡或缺乏或已被破壞；培養(yǎng)物中有少量細(xì)菌或真菌污染；試劑保存不當(dāng)；接種細(xì)胞起始濃度太低；細(xì)胞已老化；支原體污染。

解決方法：比較新培養(yǎng)液與原培養(yǎng)液成分，比較新血清與舊血清支持細(xì)胞生長實驗，讓細(xì)胞逐漸適應(yīng)新培養(yǎng)液；換入新鮮配置培養(yǎng)液，或補(bǔ)加谷氨酰胺及生長因子；用無抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)污染，丟棄培養(yǎng)物；血清需保存在-10到-20℃。培養(yǎng)液需在2-8℃避光保存。含血清培養(yǎng)液在2-8℃保存，需在1周內(nèi)用完；增加接種細(xì)胞起始濃度；換用新的保種細(xì)胞；分離培養(yǎng)物，檢測支原體。清潔支架和培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物。

三、細(xì)胞生長周期變慢，邊養(yǎng)邊漂

常見原因及解決方法：

1、細(xì)胞傳代時密度太稀或太密：建議細(xì)胞密度達(dá)80%左右進(jìn)行傳代，傳代密度適中，密度過低會延長生長周期；

2、傳代操作不當(dāng)：根據(jù)細(xì)胞特性決定細(xì)胞消化時間，一般在顯微鏡下觀察細(xì)胞回縮變圓并有少量細(xì)胞脫落即可終止消化，難消化的細(xì)胞可分次消化，每次時間不超過5min；頻繁換液或者清洗細(xì)胞也會導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)變差，常規(guī)換液時間間隔為2~3天。

四、傳代后部分細(xì)胞漂浮

常見原因及解決方法：

1、傳代前細(xì)胞密度太大：一般細(xì)胞匯合度達(dá)到80%時可進(jìn)行傳代操作，傳代密度需適中，傳代密度過高也會導(dǎo)致傳代后漂浮；

2、細(xì)胞狀態(tài)不好：可通過提高血清比例、穩(wěn)定培養(yǎng)環(huán)境等方法進(jìn)行改善；

3、吹打次數(shù)過多造成機(jī)械損傷：輕柔吹打，細(xì)胞呈單顆粒時可停止吹打，吹打過程避免氣泡產(chǎn)生；

4、培養(yǎng)基更換后不適應(yīng)：更換回原來的培養(yǎng)基；或者與原培養(yǎng)基比例混合后使用，使細(xì)胞有個適應(yīng)期。

五、傳代后細(xì)胞全部飄起

解決方法：檢查所使用的培養(yǎng)基的顏色是否偏紫色，檢查瓶蓋是否透氣，不透氣瓶蓋是否被擰松。

通常培養(yǎng)基偏堿，顏色就會偏紫，主要是因為培養(yǎng)基里的酚紅指示劑遇酸變黃、遇堿變紫，培養(yǎng)基量太少，或培養(yǎng)基存放時間太長時都會變堿。建議配好培養(yǎng)基后分裝到50mL離心管并于一周內(nèi)用完，量少時放到15mL離心管里保存。

六、傳代后細(xì)胞成團(tuán)

解決方法：

1、低密度接種，延長換液時間，防止細(xì)胞脫落；

2、使用多聚賴氨酸包被培養(yǎng)器皿，以增加細(xì)胞貼壁牢固度，降低細(xì)胞聚集成團(tuán)的幾率；

3、重新鋪板，并更換新配制的培養(yǎng)基，加大血清比例（增加比例不超過5%）；

4、接種時，減少培養(yǎng)基量（如T25加3mL）以加快細(xì)胞貼壁速度，等待細(xì)胞貼壁后（約8-12小時），再補(bǔ)加培養(yǎng)基到正常用量。

七、傳代后細(xì)胞變形

原因及解決方法如下：

1）變形，但細(xì)胞還在生長：可能是血清批次不一樣導(dǎo)致，血清成分復(fù)雜，不同批次和品牌間均存在成分差異，影響細(xì)胞狀態(tài)。建議使用同一批次血清，更換血清時需與原血清比例混合后使用，使細(xì)胞有過渡期；

2）變形，但細(xì)胞不長，且碎片增多：可能傳代操作過程損傷，常見于消化不當(dāng)，或者潛在支原體等污染導(dǎo)致細(xì)胞病態(tài)；消化時間根據(jù)每個細(xì)胞的狀態(tài)來調(diào)整，消化過度或者消化不充分均會對細(xì)胞造成影響；培養(yǎng)過程應(yīng)嚴(yán)格無菌操作，實驗環(huán)境盡量潔凈，確保細(xì)胞無外源污染。

八、細(xì)胞出現(xiàn)空泡

原因及解決方法如下：

1）正常的細(xì)胞活動：有的細(xì)胞有正常的自噬行為或其他膜泡活動，無需特殊處理（如Caco-2細(xì)胞）；

2）血清不適應(yīng)、培養(yǎng)基成分改變、換液不及時等造成細(xì)胞營養(yǎng)不良：可通過更換更合適的血清或及時換液等方法解決；

3）機(jī)械損傷、PH偏高或偏低等造成細(xì)胞受損：注意培養(yǎng)條件及操作手法。

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