重組膠原蛋白：凱氏定氮、高效液相色譜雙法解疑

最近，知名美妝護膚品牌卷入成分爭議風波。有博主質疑稱該品牌一款重組膠原蛋白精華的產品涉嫌造假，重組膠原蛋白真實添加量為0.0177%，且未檢測出膠原蛋白的核心氨基酸成分——甘氨酸。該公司聲明，產品成分標注均按法定標準執行并通過藥監部門審核備案，不存在任何成分造假或隱瞞行為。雙方爭論的核心還在于檢測方法的不同。

重組膠原蛋白作為生物醫藥與護膚領域的高效活性原料，其真蛋白含量直接決定產品的功效與質量，且氨基酸作為基本組成單元構成重組膠原蛋白的鏈狀結構，其特定序列與修飾（如羥脯氨酸）直接決定其三螺旋穩定性及生物學功能。本文使用“凱氏定氮法”檢測重組膠原蛋白中的總氮、非蛋白氮及真蛋白含量，并使用“高效液相色譜法”檢測重組膠原蛋白中的氨基酸含量，為廣大生產企業、第三方檢測機構及監管部門提供支持。

根據《YY/T 1947-2025 重組膠原蛋白敷料》中要求，重組膠原蛋白含量可按照《中華人民共和國藥典》(2020年版 四部)通則0731蛋白質含量測定法的“凱氏定氮法”進行測定，采用鎢酸鈉沉降法沉淀樣品中的蛋白質，通過差減法減去樣品中非蛋白氮含量，從而得到真蛋白含量。

儀器

海能K1160全自動凱氏定氮儀、SH420F石墨消解儀、分析天平等。

試劑

甲基紅、溴甲酚綠、硼酸、氫氧化鈉、無水硫酸鉀、五水合硫酸銅、濃硫酸、鎢酸鈉。

樣品

重組膠原蛋白修復液。

實驗過程

試劑配制完成后，進行樣品稱量。

樣品稱量

1、總氮含量測試：通過減量法準確稱取樣品5 g左右（精確至0.1 mg），并轉移至潔凈的消化管中。

2、非蛋白氮含量測試：通過減量法準確稱取樣品5 g左右（精確至0.1 mg），置于20 mL容量瓶中，加入10 mL的純水、2 mL的10%鎢酸鈉溶液和2 mL的0.33 mol/L硫酸溶液，加水定容至刻度。搖勻，靜置30分鐘后，于3000 rpm下離心5 min以促進樣品過濾。隨后取上清液進行過濾，棄去初濾液（約5滴），取續濾液，使用10 mL移液管準確量取10 mL濾液于消化管中待測。空白消化管中則需加入8 mL的純水、1 mL的10%鎢酸鈉溶液和1 mL的0.33 mo1/L硫酸溶液。

消解

向空白及樣品消化管中加入0.2 g硫酸銅、3 g硫酸鉀和10 mL濃硫酸后上機消解。消解程序如表1：

表1  SH420F石墨消解儀消解程序設置

蒸餾與滴定

待消解程序完成，消化管冷卻并無酸霧后，使用凱氏定氮儀進行檢測，定氮儀參數設置如表2：

表2  K1160全自動凱氏定氮儀試驗參數設置

測試結果

樣品經消解和上機測試，重組膠原蛋白產品中總氮、非蛋白氮及真蛋白含量如表3至表5所示：

表3  樣品中總氮含量表

表4  樣品中非蛋白氮含量表

表5  樣品中真蛋白含量表

注：表中真蛋白含量=（樣品總氮含量-非蛋白氮含量）×蛋白轉換系數（5.07）。

結論

經測試，重組膠原蛋白產品中的總氮、非蛋白氮和真蛋白含量分別為0.3348 mg/g、0.1118 mg/g和1.1306 mg/g。實驗結果表明，凱氏定氮儀可用于檢測重組膠原蛋白產品中的真蛋白含量。

高效液相色譜法檢測氨基酸時，因氨基酸自身無紫外吸收基團，需借助異硫氰酸苯酯（PITC）、鄰苯二甲醛（OPA）、丹磺酰氯（DNSCl）、2,4-二硝基氟苯（DNFB）等柱前衍生試劑引入生色基團，使衍生物具備紫外吸收特性以便被檢測。異硫氰苯酯（PITC）作為氨基酸分析中的經典柱前衍生試劑，通過與氨基酸的α-氨基特異性反應生成穩定的苯基硫代氨基甲酰（PTC）衍生物，該衍生物具有強紫外吸收特性（λmax=254nm），可顯著提升檢測靈敏度至皮摩爾級，同時其反應條件溫和、產物穩定性高且能兼容多數氨基酸（包括含羥基或含硫氨基酸），使其在高效液相色譜分析中成為兼顧靈敏度、選擇性與操作便捷性的理想選擇。本實驗采用PITC柱前衍生-高效液相色譜法檢測重組膠原蛋白中的16種氨基酸。

儀器配置

悟空K2025高效液相色譜儀：K2025 P2二元高壓輸液泵、K2025 AS自動進樣器、K2025 CO柱溫箱、K2025 UVD紫外-可見光檢測器、Wookinglab色譜工作站。

色譜條件：

色譜柱：JinGuBang AAA ，4.6×250 mm，5 μm；

流動相：流動相A為0.05 mol/L乙酸鈉水溶液，流動相B為甲醇-乙腈-水=1:3:1，梯度洗脫如下表：

進樣量：20 μL；

洗針液：90%甲醇水溶液；

柱溫：40℃；

檢測器及檢測波長：檢測器為紫外-可見光檢測器，檢測波長為254 nm。

實驗結果

1、線性范圍結果

按照色譜條件進行采集，16種氨基酸混合標準溶液的色譜圖如圖1所示，積分結果如表1所示。

圖1  16種氨基酸混合標準溶液的色譜圖

膠原蛋白含量的檢測方法多樣，具體選擇取決于樣本類型、設備條件等，可根據實驗室條件和需求選擇合適方法，必要時可結合多種技術驗證結果。