Pull-down靶蛋白質譜鑒定的原理

?? 一、Pull-down的核心原理

1. 親和標簽固定“誘餌”分子

• “誘餌”類型：

  • 蛋白質：通過基因工程表達帶標簽（如GST、His、生物素）的融合蛋白作為誘餌。

  • 小分子/核酸：將生物素標記的DNA、RNA或小分子化合物作為誘餌，通過鏈霉親和素磁珠固定。

• 固相基質：

  • 蛋白誘餌 → 結合谷胱甘肽瓊脂糖珠（GST標簽）、鎳柱（His標簽）。

  • 生物素標記物 → 鏈霉親和素磁珠（利用生物素-鏈霉親和素超高親和力，Kd≈10?¹? M）。

2. 靶蛋白的特異性捕獲

• 將固定化誘餌與待測樣本（如細胞裂解液、核蛋白提取物）孵育，靶蛋白通過空間構象互補或化學鍵結合與誘餌形成復合物。

• 洗脫雜質：多次洗滌去除未結合和非特異性結合的蛋白，降低背景噪音。

3. 復合物洗脫

• 通過改變緩沖條件（如還原劑、競爭性配體）或直接煮沸解離復合物，釋放靶蛋白。

?? 二、質譜鑒定的工作流程

捕獲的靶蛋白需經以下步驟實現高置信度鑒定：

1. 酶解肽段化

   • 洗脫蛋白經胰蛋白酶消化，生成肽段混合物。

2. 液相色譜分離（LC）

   • 肽段通過C18反相色譜柱分離，減少質譜進樣復雜度。

3. 串聯質譜分析（MS/MS）

   • 一級質譜（MS1）：測量肽段質荷比（m/z）。

   • 二級質譜（MS2）：碎片化肽段，獲得序列特征碎片離子。

4. 數據庫匹配

   • 碎片離子數據比對蛋白質數據庫（如UniProt），通過算法（如MaxQuant、Proteome Discoverer）鑒定蛋白并控制假陽性率（FDR≤1%）。

?? 三、關鍵技術變體與應用場景

1. 蛋白-蛋白互作（如GST Pull-down）

• 步驟：
  GST-誘餌蛋白表達 → 結合谷胱甘肽珠 → 孵育樣本 → 洗脫復合物 → 質譜鑒定。

• 對照設計：需設GST空標簽對照，排除非特異性結合。

2. 小分子-蛋白互作（化學蛋白質組學）

• 生物素標記法：小分子修飾生物素后與蛋白孵育，鏈霉親和素磁珠捕獲復合物。

• 生物正交法：活細胞內引入炔烴修飾小分子，通過點擊化學連接生物素，再捕獲靶蛋白。

• 應用案例：葫蘆素B通過該方法鑒定出靶點GRP78。

3. 核酸-蛋白互作（DNA/RNA Pull-down）

• DNA Pull-down：生物素標記DNA探針 + 核蛋白提取物 → 捕獲轉錄因子。

• RNA Pull-down：體外轉錄生物素RNA + 胞漿蛋白 → 鑒定RNA結合蛋白。

?? 四、關鍵注意事項與優化策略

1. 降低假陽性

   • 嚴格設置陰性對照（如空標簽、游離生物素對照）。

   • 優化洗滌條件（鹽濃度、去垢劑）減少非特異結合。

2. 提高靈敏度

   • 增加起始樣本量（>1 mg蛋白）。

   • 避免角蛋白污染：操作時佩戴手套、頭套。

3. 兼容性質控

   • 銀染樣品需特殊處理（如ProteoSilver Plus試劑），避免質譜抑制。

   • 低豐度樣本（<10 μg）需減少SDS用量，降低鹽濃度。

?? 五、技術優勢與局限

• ? 優勢：

  • 直接檢測生理條件下的弱相互作用（如低豐度蛋白）。

  • 兼容多種分子類型（蛋白、核酸、小分子）。

  • 質譜鑒定覆蓋率高（可達pg級靈敏度）。

• ? 局限：

  • 體外環境無法模擬細胞內動態環境。

  • 標簽可能影響誘餌蛋白構象（如GST形成二聚體）。

  • 小分子標記后可能改變其結合特性。

Pull-down與質譜聯用流程概覽

以下表格總結了該技術的關鍵實驗階段：

總結

Pull-down靶蛋白質譜鑒定的核心是 “誘餌固定-靶標捕獲-質譜解密” 三部曲。其普適性和高靈敏度使其成為互作組學研究的主流工具，但需通過嚴謹的對照設計和樣品優化保障結果可靠性。結合功能驗證（如點突變、Co-IP），可進一步將互作數據轉化為機制洞察