細胞免疫熒光檢測服務的知識與應用及技術操作流程！

一、背景

細胞免疫熒光檢測服務是根據抗原抗體反應的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光素制成熒光標記物，再用這種熒光抗體（或抗原）作為分子探針檢查細胞或組織內的相應抗原（或抗體）。在細胞或組織中形成的抗原抗體復合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標本，熒光素受激發光的照射而發出明亮的熒光（黃綠色或桔紅色），可以看見熒光所在的細胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質、定位，以及利用定量技術測定含量。

免疫熒光技術（Immunofluorescence technique）是在免疫學、生物化學和熒光成像系統基礎上建立起來的檢測技術。技術原理是根據抗體-抗原特異結合，以熒光標記抗體示蹤組織或細胞內相應抗原。免疫熒光技術因特異性強、靈敏度高和操作簡便的優勢廣泛應用于免疫學、微生物學、病理學、腫瘤學以及臨床檢驗等生物學和醫學。

免疫學的基本反應是抗原-抗體反應。由于抗原抗體反應具有高度的特異性，所以當抗原抗體發生反應時，只要知道其中的一個因素，就可以查出另一個因素。免疫熒光技術就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標記在抗體（或抗原）上，與其相應的抗原（或抗體）結合后，在熒光顯鏡下呈現一種特異性熒光反應。

二、技術流程

1、細胞爬片：將細胞按20%-30%的匯合度接種到24孔細胞培養板中的圓形蓋玻片上。

2、細胞固定：4%冷的多聚甲醛固定20分鐘，PBS洗三遍。

3、細胞通透：Triton X-100通透20分鐘，PBS洗三遍。

4、封閉：用與二抗相同宿主的血清封閉30分鐘，PBS洗三遍。

5、一抗孵育：一抗4度濕盒內過夜，也可37度2小時，PBS洗三遍。

6、二抗孵育：二抗室溫孵育2小時或者37度1.5小時（避光），PBS洗三遍。

7、DAPI染核：在二抗孵育1小時后加入終濃度為100ng/ml的DAPI繼續孵育。然后可在熒光顯微鏡下觀察或直接封片保存。

8、甘油封片：在載玻片上滴一小滴甘油，小心地將細胞爬片從細胞培養板中取出來，種植有細胞的一面朝下輕輕的蓋在甘油上，避免產生過氣泡。4度孵育過夜晾干。

三、應用

細胞免疫熒光檢測服務可用于循環腫瘤細胞檢測：

外周血循環腫瘤細胞(circulating tumor cells,CTCs)存在于多種惡性腫瘤中,其檢測對于腫瘤早期診斷、預后分析、療效檢測以及個體化治療等眾多方面具有重要的臨床意義,并因能夠實時檢測、創傷小等優點成為備受關注的“液態活檢”。基于ISET原理,通過前期研究建立了改良ISET檢測CTCs技術體系,主要工作基礎包括：建立了改良ISET手工實驗裝置、改良了染色方法、提高了腫瘤細胞截留率,研究結果表明該技術體系檢測效果較為理想,腫瘤細胞截留率可達80%以上,染色后的細胞形態學結構可辨,能區分典型的CTCs與正常白細胞。

聯合細胞免疫熒光技術,建立ISET聯合細胞免疫熒光檢測循環腫瘤細胞技術體系,并通過檢測23侈Ⅲ/Ⅳ期腫瘤患者外周血循環腫瘤細胞進行臨床預研究。通過對課題組前期ISET技術進行優化,聯合細胞免疫熒光技術,建立了ISET-ICC檢測CTCs技術體系。通過細胞蠟塊-免疫組化技術體系,驗證了ISET-ICC技術體系分離獲得的CTCs性質,證實了EMT的存在。

通過與CellSearch、CTC-Biopsy兩種CTCs檢測方法對比,證實了ISET-ICC技術具有臨床應用可行性,能夠用于肺癌、食管癌、胃癌、結直腸癌、腎癌、肝癌患者的CTCs檢測。ISET聯合細胞免疫熒光技術能檢測到上皮間質轉化的循環腫瘤細胞以及循環腫瘤微栓,而這兩種細胞是造成CellSearch假陰性的主要原因。ISET聯合細胞免疫熒光技術能夠輔助鑒定CTC-Biopsy方法富集的CTCs。

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