人胚腎上皮包裝細胞的背景與應用及培養(yǎng)操作規(guī)程！

一、背景

人胚腎上皮包裝細胞是在293細胞株上插入免疫缺陷病毒SV40 T-抗原基因后產(chǎn)生的高轉染效率衍生株，廣泛用于包裝慢病毒，其轉染效率比293細胞高很多，是研究基因功能的一個強大工具。

二、人胚腎上皮包裝細胞培養(yǎng)操作規(guī)程

1、人胚腎上皮包裝細胞培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：

1）準備DMEM培養(yǎng)基(DMEM，GIBCO，貨號11965-092)，90%；胎牛血清，10%。

2）人胚腎上皮包裝細胞培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3）人胚腎上皮包裝細胞凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。液氮儲存。

2、人胚腎上皮包裝細胞處理：

1）復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細胞密度。

2）人胚腎上皮包裝細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

對于貼壁細胞，傳代可參考以下方法：

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3ml此細胞的培養(yǎng)基終止消化。

3.輕輕吹打后吸出，移入15ml離心管中，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)液后吹勻。

4.移入到事先準備好的含有5ml培養(yǎng)基的T-25培養(yǎng)瓶中或含有14ml培養(yǎng)基的T-75培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

3）人胚腎上皮包裝細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。貼壁細胞凍存時，先要消化處理并進行細胞計數(shù)。消化方法按照細胞傳代方法的1-3步驟進行，最后的重懸液使用血清。懸浮細胞直接計數(shù)后離心，用血清重懸浮，加DMSO至最終濃度為10%。加入DMSO后迅速混勻，按每1ml的數(shù)量分配到凍存管中。

三、應用

人胚腎上皮包裝細胞可以用于NF-κB轉錄因子報告基因系統(tǒng)的構建優(yōu)化及在篩選促TRAIL抗腫瘤藥物中的應用：

從抑制TRAIL激活的促存活信號通路NF-κB角度著手,嘗試增強TRAIL抗腫瘤的活性。

分為以下四個部分：

1)NF-κB轉錄因子報告基因系統(tǒng)的構建及優(yōu)化;

2)利用該系統(tǒng)篩選能下調NF-κB表達量或抑制NF-κB活性的中藥成分;

3)將2)中篩選出的中藥成分與TRAIL聯(lián)用,檢測其對A549、COLO205等腫瘤細胞的殺傷效果;

4)對3)中中藥成分促進TRAIL抗腫瘤活性機制進行初步探索。

研究方法與結果：

1、穩(wěn)定表達NF-κB轉錄因子熒光素酶報告基因系統(tǒng)的構建及驗證。

利用分子克隆的酶切、連接等基本操作,先將逆轉錄病毒載體pQCXIP原有的CMV啟動子去除,再分別插入NF-κB增強子序列以及熒光素酶NanoLuc(NLuc)報告基因序列,構建了受轉錄因子NF-κB調控的熒光素酶NLuc報告基因表達載體pQCXIP-NF-κB-NLuc。將構建的pQCXIP-NF-κB-NLuc質粒與病毒包裝質粒pVSVG一起用陽離子脂質體法轉染人胚腎上皮包裝細胞GP2-293細胞系制備相應的逆轉錄病毒,侵染人宮頸癌細胞系HeLa,通過嘌呤霉素篩選出表達相應抗性基因的陽性細胞,并進一步篩選出對NF-κB通路陽性刺激物TNFα最敏感的細胞克隆。該細胞株對TNFα的刺激呈現(xiàn)出濃度梯度、時間依賴性,表明受NF-κB轉錄因子調控的穩(wěn)定表達NLuc熒光素酶的細胞系PP-NF-κB-NLuc-HeLa構建成功,可用于定量檢測NF-κB的活化效果及篩選與NF-κB活化調控相關的藥物等。

2、優(yōu)化構建的熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測方式。

在上述構建好的熒光素酶報告基因系統(tǒng)的應用過程中發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基的pH、培養(yǎng)基中的血清對NLuc熒光素酶的檢測有影響,對于后續(xù)藥物調控功能的檢測存在不利影響,因此在初步確定了pH及血清的原因后,選取了NLuc熒光素酶發(fā)光強度較強及相對穩(wěn)定的添加0.03%(V/V)Triton X-100的PBS緩沖液(PBST)作為Nluc酶的檢測體系。

3、篩選下調NF-κB的中藥成分。在成功完成了系統(tǒng)的構建及NLuc熒光素酶的檢測體系優(yōu)化后,利用該系統(tǒng)對36種中藥粗提物或單體進行了檢測,并初步篩選出了12種能降低NF-κB活性或下調NF-κB表達量的中藥粗提物或單體,在排除了有強細胞毒性的、有相關與TRAIL聯(lián)用抗腫瘤報道的、促腫瘤增殖的成分等之后,最終選取了QD6-4、SKN兩種中藥單體進一步研究其與TRAIL的聯(lián)用的效果。

4、篩選到的中藥單體與TRAIL聯(lián)用對腫瘤的殺傷檢測。細胞活力檢測實驗結果表明,兩種單體分別與TRAIL聯(lián)用作用于人肺癌細胞系A549及結直腸癌細胞系COLO205細胞后,QD6-4對這兩個細胞系幾乎無任何促進TRAIL抗腫瘤活性的作用,SKN對COLO205幾乎無作用,但能顯著增強TRAIL對A549的殺傷,且在SKN使用濃度為2-8μM時有協(xié)同效果。進一步的實驗結果表明,SKN對人結直腸癌細胞系HCT116、人宮頸癌細胞系HeLa、人胰腺癌細胞系PANC-1細胞系也均表現(xiàn)出了促進TRAIL殺傷的效果,其中在使用濃度為2-8μM時對HeLa和PANC-1細胞的殺傷作用均表現(xiàn)出了協(xié)同效果,且對PANC-1細胞系的協(xié)同效果尤為明顯。

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