提高 SDS-PAGE 凝膠電泳分辨率的其他操作流程

合理選擇凝膠濃度：依據目標蛋白質分子量精準匹配凝膠濃度是關鍵。當分析小于 20kDa 的小分子蛋白質時，12% - 15% 的高濃度凝膠能提供更細密的分子篩效應，限制小分子蛋白質的遷移，實現精細分離；而對于大于 100kDa 的大分子蛋白質，7% - 10% 的低濃度凝膠更合適，較大的孔徑可確保大分子順利通過凝膠。若樣品蛋白質分子量范圍跨度大，梯度凝膠（如 4% - 20%）能實現從低濃度到高濃度的過渡，使不同大小蛋白質在凝膠的不同區域得到最佳分離 。

嚴格把控凝膠聚合：聚合過程中，溫度、催化劑用量都會影響凝膠質量。將聚合溫度嚴格控制在 20 - 25℃，能保證凝膠孔徑均勻；精確添加過硫酸銨（APS）和四甲基乙二胺（TEMED），APS 作為引發劑，TEMED 加速聚合反應，二者比例失調會導致凝膠聚合異常。同時，新鮮配制 APS 溶液，且 1 周內使用，可保證其活性，避免因引發劑失效造成聚合、孔徑不均的問題。

精準控制上樣量：上樣量過多會使蛋白質在凝膠中過度堆積，導致條帶拖尾、重疊，嚴重影響分辨率。一般每孔總蛋白上樣量控制在 10 - 20μg，純化蛋白質樣品 5 - 10μg 即可。使用校準后的微量移液器，緩慢且精準地吸取和添加樣品，防止樣品溢出污染相鄰泳道，同時保證各泳道上樣量一致，避免因上樣差異干擾分辨率。

優化樣品變性處理：樣品與上樣緩沖液混合后，煮沸時間需精準控制。通常 5 - 10 分鐘為宜，時間過短蛋白質無法充分變性，影響其在凝膠中的遷移；時間過長，部分蛋白質可能發生聚集，形成大分子復合物，改變遷移特性。對于含大量二硫鍵的蛋白質，可適當延長煮沸時間至 10 分鐘，確保二硫鍵充分斷裂，使蛋白質伸展為線性分子。

優化電泳緩沖液：Tris - 甘氨酸緩沖液是常用選擇，但要確保其 pH 穩定在 8.3 左右，pH 波動會改變蛋白質所帶電荷，影響遷移速度和分離效果。定期更換電泳緩沖液，隨著電泳進行，緩沖液中離子不斷消耗，離子強度改變會影響電場穩定性和蛋白質遷移，一般連續使用 2 - 3 次后更換新緩沖液。對于對分辨率要求高的小分子蛋白質分離，可嘗試 MOPS 或 MES 緩沖系統，它們能提供更穩定的 pH 環境和更好的分離效果。

調整電泳電壓與時間：降低電泳電壓并適當延長電泳時間，可使蛋白質在凝膠中遷移更充分，減少擴散，獲得更清晰條帶。例如，將電壓從 200V 降至 100V，雖然電泳時間延長，但蛋白質有更充足時間依據分子量差異進行分離，分辨率顯著提高。同時，采用分步電壓策略，開始用較低電壓（如 80V）使蛋白質在凝膠中均勻分布，再逐步升高電壓（如 120V）加快分離進程，也是提升分辨率的有效方法。

運用梯度凝膠電泳：梯度凝膠的孔徑沿凝膠長度方向逐漸變化，蛋白質在遷移過程中，隨著孔徑變小，不同分子量蛋白質在合適孔徑處停止遷移，實現更精細分離。相較于均一濃度凝膠，梯度凝膠能在同一凝膠上分離更寬分子量范圍的蛋白質，且條帶更銳利、分辨率更高，尤其適合復雜蛋白質混合物分析。

選擇高質量預制膠與設備：高質量預制膠經過嚴格質量控制，凝膠濃度均一、聚合條件穩定，能減少因手工制膠誤差導致的分辨率降低問題。同時，確保電泳槽干凈無污染，殘留的 SDS、蛋白質會干擾電場分布和蛋白質遷移；使用精準控溫、穩定電場的電泳儀，為蛋白質分離提供穩定環境，也是提高分辨率的重要保障。