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蛋白發(fā)光染液：蛋白質(zhì)檢測的關(guān)鍵技術(shù)工具
DyLight 系列：DyLight 系列熒光染料涵蓋了從可見光到紅外光區(qū)域的多種產(chǎn)品，如 DyLight 488、DyLight 549、DyLight 649、DyLight 680 和 DyLight 800 等。這些染料的激發(fā)和發(fā)射光譜與常見的激光和濾光片組兼容，在免疫分析、蛋白質(zhì)印跡、微陣列、細胞染色、流式細胞術(shù)和免疫熒光等多種應(yīng)用中表現(xiàn)出色。例如，在免疫熒光實驗中，DyLight 染料標(biāo)記的抗體能夠清晰地顯示細胞內(nèi)目標(biāo)蛋白的定位和分布，為研究蛋白質(zhì)的功能和細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑提供了有力工具。苯Pro - Q Diamond 熒光染料：該染料專門用于磷酸化蛋白質(zhì)的染色。其具有方便、快速、高靈敏度的特點，線性范圍超過 3 個數(shù)量級，并且與質(zhì)譜鑒定兼容。在 2003 年由 Molecular Probes 的 Wavne Patton 報道，其激發(fā)光波長為 488 nm，吸收峰波長為 532 nm。研究人員通過將一些蛋白質(zhì)和肽點樣在蛋白質(zhì)芯片上，使用 Pro - Q Diamond 檢測芯片上蛋白質(zhì)和肽的磷酸化水平，靈敏度可達 312 - 625 fg，為信號通路和磷酸酶抑制研究提供了良好的平臺 。
ProteOrange® 染料：用于聚丙烯酰胺凝膠電泳后蛋白質(zhì)的快速可視化。它是一種含有兩性離子片段的芪型熒光團，在核酸、多糖和其他分子存在的情況下，蛋白質(zhì) / 十二烷基硫酸鈉膠束（SDS）會選擇性地結(jié)合該染料。分子量在 6 kDa 及以上的蛋白質(zhì)可被有效染色，熒光信號與蛋白質(zhì)濃度在三個數(shù)量級的濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。ProteOrange 凝膠染色的靈敏度約為考馬斯亮藍染色的十倍，雖然低于銀染色，但與銀染色相比，其染色方案要簡單得多，不需要洗滌，對于標(biāo)準(zhǔn) SDS - PAGE 也不需要固定步驟。整個染色過程 30 - 60 分鐘即可完成，包括將凝膠在含有染料的 7.5% 乙酸水溶液中孵育，然后用 7.5% 乙酸短暫沖洗 30 秒。使用波長為 312 - 365 nm 的透射儀即可進行可視化。
Lumitein™蛋白質(zhì)凝膠染色劑：設(shè)計用于檢測 SDS 聚丙烯酰胺（SDS - PAGE）凝膠中的蛋白質(zhì)，經(jīng)過額外的 SDS 孵育步驟后，也可用于檢測天然 PAGE 凝膠中的蛋白質(zhì)。該染色劑具有靈敏度，可檢測到小于 1 ng 的蛋白質(zhì)，與銀染色靈敏度相當(dāng)。操作簡單快速，固定和染色可在 30 - 90 分鐘內(nèi)一步完成，隨后只需用清水簡單沖洗。背景極低，與常見儀器兼容，可使用 300 nm 紫外凝膠盒（EB 濾光片）、Dark Reader 或激光掃描儀進行成像。線性檢測范圍寬，至少可達三個數(shù)量級，并且與下游分析（如質(zhì)譜和測序）兼容，在室溫下穩(wěn)定性高 。
樣品制備與電泳：首先，將待檢測的蛋白質(zhì)樣品進行處理，如細胞裂解、組織勻漿等，以提取蛋白質(zhì)。然后通過十二烷基硫酸鈉 - 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS - PAGE）根據(jù)蛋白質(zhì)分子量大小對其進行分離。
轉(zhuǎn)膜：將凝膠上分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相膜（如 PVDF 膜或硝酸纖維素膜）上，使蛋白質(zhì)固定在膜上，便于后續(xù)與抗體結(jié)合。
封閉：用含有封閉劑（如 5% 脫脂奶粉或 BSA）的緩沖液孵育膜，封閉膜上非特異性結(jié)合位點，減少背景信號。
一抗孵育：將膜與特異性識別目標(biāo)蛋白的一抗孵育，一抗與目標(biāo)蛋白特異性結(jié)合。孵育條件通常為 4℃過夜或室溫孵育 1 - 2 小時，具體時間根據(jù)抗體說明書確定。
二抗孵育：用洗滌緩沖液（如 PBST）充分洗滌膜后，加入與一抗來源物種匹配的辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗。二抗與一抗結(jié)合，從而將 HRP 標(biāo)記到目標(biāo)蛋白所在位置。二抗孵育一般在室溫下進行 1 - 2 小時。
洗膜：再次用洗滌緩沖液充分洗滌膜，去除未結(jié)合的二抗，以降低背景信號。
發(fā)光液混合與孵育：新鮮配制 ECL 工作液，將 A 液和 B 液按照 1:1 的比例混合均勻。將混合后的發(fā)光液均勻覆蓋在膜表面，確保膜浸潤在發(fā)光液中，室溫孵育 1 - 5 分鐘，使發(fā)光反應(yīng)充分進行。
信號檢測：孵育完成后，用鑷子小心取出膜，去除多余的發(fā)光液（可將膜輕靠在吸水紙上吸干多余液體，但避免膜干燥）。若使用 X 射線膠片檢測，將膜放入雜交袋中，排出空氣后密封，在暗室中將膠片覆蓋在膜上曝光適當(dāng)時間（根據(jù)信號強度調(diào)整曝光時間，從幾秒到數(shù)小時不等），然后進行膠片顯影和定影處理；若使用化學(xué)發(fā)光成像儀檢測，將膜放入成像儀樣品室中，設(shè)置合適的曝光時間和增益參數(shù)，進行圖像采集和分析 。
染料選擇與準(zhǔn)備：根據(jù)實驗?zāi)康暮偷鞍踪|(zhì)特性選擇合適的熒光染料，并按照說明書要求將染料溶解在適當(dāng)?shù)娜軇┲校渲瞥伤铦舛鹊墓ぷ饕骸?/span>
蛋白質(zhì)標(biāo)記：將待標(biāo)記的蛋白質(zhì)與熒光染料工作液按照一定比例混合，在適當(dāng)條件下孵育，使染料與蛋白質(zhì)充分結(jié)合。反應(yīng)條件（如溫度、時間、pH 值等）需根據(jù)染料類型和蛋白質(zhì)性質(zhì)進行優(yōu)化。例如，對于一些與氨基反應(yīng)的熒光染料，通常在中性或弱堿性條件下進行標(biāo)記反應(yīng)，孵育時間一般為 1 - 2 小時。
標(biāo)記后處理：標(biāo)記反應(yīng)完成后，通過透析、超濾或凝膠過濾等方法去除未結(jié)合的游離染料，以獲得純凈的標(biāo)記蛋白質(zhì)樣品。
檢測與分析：將標(biāo)記好的蛋白質(zhì)樣品用于后續(xù)實驗，如免疫熒光染色、流式細胞術(shù)分析等。在檢測過程中，使用相應(yīng)的熒光激發(fā)光源和檢測設(shè)備，根據(jù)熒光信號的強度、分布等參數(shù)對蛋白質(zhì)進行定性和定量分析。例如，在免疫熒光染色實驗中，將標(biāo)記蛋白質(zhì)的樣品與細胞或組織切片孵育，然后在熒光顯微鏡下觀察熒光信號，確定蛋白質(zhì)在細胞或組織中的定位和表達水平 。
蛋白質(zhì)表達與功能研究：在探究基因功能時，需要了解基因表達產(chǎn)物 —— 蛋白質(zhì)的表達水平和功能。通過使用蛋白發(fā)光染液，科研人員可以準(zhǔn)確檢測蛋白質(zhì)在不同細胞系、組織或發(fā)育階段的表達變化。例如，在研究腫瘤發(fā)生機制時，利用 ECL 超敏發(fā)光液結(jié)合 Western Blot 技術(shù)，檢測腫瘤相關(guān)蛋白在正常細胞和腫瘤細胞中的表達差異，有助于發(fā)現(xiàn)潛在的腫瘤標(biāo)志物和治療靶點。在蛋白質(zhì)功能研究方面，通過熒光染料標(biāo)記蛋白質(zhì)，可以實時追蹤蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)的定位、運動和相互作用，深入了解蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能和參與的信號通路 。
蛋白質(zhì)修飾研究：蛋白質(zhì)的修飾（如磷酸化、乙酰化、甲基化等）對其功能具有重要調(diào)節(jié)作用。Pro - Q Diamond 等專門用于檢測特定修飾蛋白質(zhì)的發(fā)光染液，為研究蛋白質(zhì)修飾提供了有力手段。通過檢測修飾蛋白質(zhì)的含量和分布變化，研究人員可以揭示蛋白質(zhì)修飾在細胞生理過程、疾病發(fā)生發(fā)展中的作用機制 。
重組蛋白生產(chǎn)與質(zhì)量控制：在重組蛋白藥物的生產(chǎn)過程中，需要對重組蛋白的表達、純化和質(zhì)量進行嚴(yán)格監(jiān)控。蛋白發(fā)光染液可用于檢測重組蛋白的表達水平、純度以及是否存在降解產(chǎn)物。例如，在發(fā)酵液中提取重組蛋白后，使用 Lumitein™蛋白質(zhì)凝膠染色劑檢測蛋白質(zhì)含量和純度，確保產(chǎn)品質(zhì)量符合標(biāo)準(zhǔn)。同時，通過熒光染料標(biāo)記重組蛋白，可以研究其在體內(nèi)的藥代動力學(xué)和藥效學(xué)特性，為藥物研發(fā)提供重要數(shù)據(jù) 。
生物制品檢測：對于疫苗、抗體等生物制品，需要檢測其中蛋白質(zhì)的含量、活性和穩(wěn)定性。蛋白發(fā)光染液能夠快速、準(zhǔn)確地檢測生物制品中的蛋白質(zhì)成分，保障產(chǎn)品的安全性和有效性。例如，在流感疫苗生產(chǎn)過程中，利用 ECL 發(fā)光染液檢測疫苗中流感病毒蛋白的含量，確保疫苗劑量準(zhǔn)確 。
疾病標(biāo)志物檢測：在臨床診斷中，檢測血液、尿液等體液中的疾病標(biāo)志物是早期診斷和病情監(jiān)測的重要手段。許多疾病標(biāo)志物為蛋白質(zhì)，通過蛋白發(fā)光染液結(jié)合免疫檢測技術(shù)，可以高靈敏度地檢測這些微量蛋白質(zhì)。例如，使用 ECL 超敏發(fā)光液檢測血液中的癌胚抗原（CEA）、甲胎蛋白（AFP）等腫瘤標(biāo)志物，有助于腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)和預(yù)后判斷；檢測血清中的心肌肌鈣蛋白等蛋白質(zhì)標(biāo)志物，可用于急性心肌梗死的快速診斷 。
自身免疫性疾病診斷：自身免疫性疾病患者體內(nèi)會產(chǎn)生針對自身蛋白質(zhì)的抗體。通過檢測這些自身抗體，結(jié)合蛋白發(fā)光染液進行免疫印跡分析，可以輔助診斷自身免疫性疾病。例如，檢測抗核抗體、抗雙鏈 DNA 抗體等自身抗體時，使用熒光染料標(biāo)記的二抗，通過觀察熒光信號來判斷抗體的存在和滴度，為系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病的診斷提供依據(jù) 。
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