格特隱球菌性腦膜炎的臨床特征和實驗室檢查研究進展！

隱球菌病（cryptococcosis）是一種人和動物的全身性真菌病，由新型隱球菌（Cryptococcus neoformans，C.neoformans）和格特隱球菌（Cryptococcus gattii，C.gattii）感染引起。隱球菌可感染幾乎所有的器官和組織，且對中樞神經系統有很強的傾向性，與其特異性毒力因素有關：如促進穿透血腦屏障的特異性金屬蛋白酶、脲酶、透明質酸水平增加和提高神經免疫調節的漆酶活性，以及在缺乏營養的大腦環境中促進生存的機制，如自噬和高親和力糖轉運蛋白。因此， 隱球菌感染的患者常表現為腦膜炎。格特隱球菌一直被認為是一種澳大利亞的地方性病原體，20世紀90年代開始逐漸出現在加拿大和美國，引起學者們的重視。格特隱球菌性腦膜炎的臨床表現、實驗室檢查、治療和預后與隱球菌性腦膜炎不同。文中將綜述格特隱球菌性腦膜炎的臨床特征、實驗室檢查的研究進展。

1、格特隱球菌性腦膜炎的臨床特征

1.1 流行病學美國大多數實驗室未將隱球菌鑒定到物種水平，且為自愿報告。因此，格特隱球菌病的流行病學調查非常不完整。加拿大溫哥華市每年的格特隱球菌病發病率為8.5-37例/100萬居民，但澳大利亞發生率每年僅為0.94例/100萬居民。這一現象與溫哥華市要求強制上報格特隱球菌感染病例有關。格特隱球菌引起的隱球菌病在的發病率（20%）明顯低于新型隱球菌（80%）。非洲地區很少報道格特隱球菌感染，人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）陽性的隱球菌病患者中有2.2%-12.3%是由格特隱球菌引起的。

格特隱球菌主要分布于熱帶和亞熱帶夏季濕熱的地區，如澳大利亞北部和南美洲。研究發現，免疫功能正常的格特隱球菌病患者可出現在溫帶夏季溫暖干燥的地區，如：加拿大、美國和中國。而且利用傳統和分子學檢測方法在熱帶和溫帶地區的土壤、樹木和鳥糞等自然環境中發現了格特隱球菌。溫帶地區出現格特隱球菌感染的可能原因包括：氣候變化、旅行人數的增加和人為活動等，但確切的機制仍然未知。感染格特隱球菌的患者中，男性多于女性，成人多于兒童。這可能與成年男性更多的暴露于自然環境有關。 以往認為格特隱球菌主要感染免疫功能正常的個體。然而， 報告顯示這些免疫功能正常的感染者往往有一些潛在的疾病，可能與免疫抑制有關，也報告了HIV陽性患者感染格特隱球菌性腦膜炎的病例。

1.2 發病機制格特隱球菌通過呼吸進入人體，潛伏在肺內淋巴結，經血液傳播而發展為肺和中樞神經系統感染。格特隱球菌通過兩種途徑進入中樞神經系統，其一為跨細胞途徑：格特隱球菌經血液進入大腦，通過其莢膜上的透明質酸與腦微血管內皮細胞表面的CD44受體結合，進入內皮細胞。通過改變內皮細胞滲透性進入血管周圍間隙，再通過脲酶、漆酶、磷脂酶B1和絲氨酸蛋白酶參與促進其遷移。其二為細胞旁途徑：格特隱球菌是一種兼性胞內病原體，能夠在吞噬細胞酸性環境中存活和增殖，并將其作為“特洛伊木馬”形式進入血管周圍間隙，被吞噬細胞釋放的隱球菌，分泌金屬蛋白酶突破星形細胞之間的緊密連接進入腦實質。

1.3 臨床表現格特隱球菌性腦膜炎是一種亞急性腦膜炎，臨床表現為頭痛和精神狀態改變，以及發熱和嘔吐等共性癥狀。格特隱球菌容易產生隱球菌瘤，對治療反應較慢、潛伏期較長，容易產生嚴重的中樞神經系統炎癥、高顱壓和神經系統后遺癥。 典型表現為頭痛、嘔吐和頸強直，還可能出現腦神經受累、視覺和聽力下降或喪失、小腦功能異常、部分肢體無力、癲發作和精神狀態異常（性格改變、意識不清和昏迷）。

50%-60%的格特隱球菌性腦膜炎患者可出現顱內壓升高（壓力＞200mmH2O，1mmH2O=0.0098kPa）。盡管顱內壓升高不是死亡的危險因素，但可預測12個月后的神經后遺癥和（或）死亡（P＜0.05）。 顱內壓升高由腦實質炎癥、間質水腫和腦脊液吸收減少引起。腦脊液流出減少可能是因為菌體及其莢膜在蛛網膜顆粒處引起炎癥反應，影響蛛網膜絨毛細胞對腦脊液的吸收所致。

格特隱球菌性腦膜炎患者在診斷或治療期間容易出現炎癥后遺癥，如腦積水，可能與格特隱球菌誘導的促炎細胞因子分泌水平更高有關。眼部并發癥也較明顯，特別是顱內壓升高時，常出現視乳頭水腫。此外，視力模糊、視野缺損、眼外肌麻痹、瞳孔調節功能受損、脈絡膜炎、視網膜出血、眼內炎、視神經等均有見報道。

接受抗真菌治療的隱球菌性腦膜炎患者在接受抗逆轉錄病毒治療前癥狀緩解，在接受抗逆轉錄病毒治療后癥狀加重或復發，稱為免疫重建炎癥綜合征（immune reconstitution inflammatory syndrome，IRIS），偶見于懷孕和免疫功能受損的格特隱球菌性腦膜炎患者。免疫功能正常HIV陰性的格特隱球菌性腦膜炎患者，甚至會出現更嚴重的中樞神經系統癥狀，表現為IRIS樣綜合征或無菌性蛛網膜炎。

2、實驗室檢查

2.1 檢測格特隱球菌的意義 新型隱球菌主要易感染HIV陽性和患者，范圍內發病率較高，而格特隱球菌性腦膜炎較少見，易被誤診或漏診。因此，格特隱球菌的鑒定診斷很重要。

宿主的免疫狀態無明顯區別時，格特隱球菌性腦膜炎患者有更嚴重的臨床表現。需要接受更長時間的抗真菌藥物治療或手術治療，積極降低顱內壓和早期使用地塞米松治療。格特隱球菌性腦膜炎病死率更高，早期診斷對于格特隱球菌性腦膜炎的治療和預后至關重要。

分子檢測技術在真菌學領域的應用，對格特隱球菌和新型隱球菌的遺傳多樣性和基因型的流行病學提供了更詳細的認識。研究發現，不同分子型的格特隱球菌毒力不同，臨床表現和對藥物的敏感性也不同，因此分子學檢測對診斷十分重要。

2.2 隱球菌的一般檢測方法目前隱球菌的常用檢測方法主要用于檢測新型隱球菌，分為真菌學、生理生化和分子學鑒定。真菌學鑒定主要包括：腦脊液墨汁染色、阿利新蘭染色、腦脊液細胞學邁-格-姬（MGG）染色和腦脊液隱球菌培養。生理生化實驗多采用商品化試劑， 目前常用的API-20C Aux可在72h內檢測出新型隱球菌。分子學方法檢測隱球菌莢膜抗原有：乳膠凝集實驗、酶聯免疫吸附法及側流免疫層析法等。其中，側流免疫層析法簡單、快速，敏感度和特異度均較高，可應用于臨床的快速篩查。這些方法可檢查隱球菌，但進一步鑒別新型隱球菌和格特隱球菌還需使用其他檢測方法。

2.3 格特隱球菌的鑒別方法

2.3.1 真菌學方法L型刀豆氨酸-甘氨酸-溴麝香草酚藍（L-canavanine-glycine-bromothymol blue，CGB）培養基可在27℃的環境下，40-44h檢測（大多數分離株在24h時無生長）格特隱球菌。 如果菌落周圍培養基變為藍色，結果為陽性；保持黃綠色，結果為陰性，敏感度和特異度分別為93%。

2.3.2 分子生物學方法分子生物學方法不僅可以鑒別格特隱球菌，還可以確定其分子型，包括：多重PCR檢測，隨機擴增多態性DNA、PCR指紋圖譜分析、限制性片段長度多態性分析、擴增片段長度多態性分析和多位點序列分析。多重PCR檢測臨床樣本的敏感度和特異度為94.8%和98.5%，目前尚無其他分子學檢測方法敏感度和特異度的報道。

3、診斷與鑒別診斷

3.1 診斷格特隱球菌性腦膜炎是一種亞急性腦膜炎，臨床表現為頭痛、發熱、嘔吐和精神狀態改變，缺乏特異性。 影像學檢查除隱球菌瘤外，無其他特異性表現。因此，對于任何伴有中樞神經系統感染相關癥狀和體征的患者，無論其是否有免疫功能缺陷，均應考慮格特隱球菌性腦膜炎的可能，進一步行腰椎穿刺腦脊液檢查。 首先使用腦脊液染色、莢膜抗原檢測等常用檢測方法確定隱球菌，然后使用L型刀豆氨酸-甘氨酸-溴麝香草酚藍培養鑒別格特隱球菌，還可以使用分子生物學及宏基因組二代測序等方法進一步確定分子型。

3.2 鑒別診斷隱球菌屬有30多個種型，常見的致病種型僅有新型隱球菌和格特隱球菌， 因為新型隱球菌和格特隱球菌能夠在37℃下生存，并且存在其他致病因素，如產生黑色素和保護性莢膜。格特隱球菌性腦膜炎的流行病學、臨床表現、實驗室檢查、治療和預后與隱球菌性腦膜炎均不同，可根據這些特征鑒別。

4、治療及預后

4.1 治療抗真菌藥物治療的一線治療方案自1997年以來沒有明顯變化，分為3步：誘導期（兩性霉素B和氟胞嘧啶，×2周）、鞏固期（氟康唑400-800mg/d，×8周）和維持期（氟康唑200mg/d，×1年）。多項研究表明， 兩性霉素B與氟胞嘧啶聯合應用對格特隱球菌的清除迅速，兩藥聯合應用較單用兩性霉素B更有利于預后。

目前， 格特隱球菌性腦膜炎的治療建議與新型隱球菌性腦膜炎相似，誘導期兩性霉素B（0.7-1.0mg/kg/d）與氟胞嘧啶（100mg/kg/d）聯合應用，隨后改用氟康唑400-800mg/d，也可選用伊曲康唑200mg/d，伏立康唑4mg/kg（12h 1次）。但格特隱球菌性腦膜炎患者需要延長兩性霉素B和氟胞嘧啶的療程，因為預后與兩藥聯合使用的療程有關，治療的誘導期需要更長，平均為6周。格特隱球菌對抗真菌藥物的敏感度與新型隱球菌不同，格特隱球菌VG II基因型對氟康唑的敏感度較低，對伏立康唑和泊沙康唑的敏感度持續存在，提示在鞏固期應使用伏立康唑替代氟康唑。 氟康唑和伊曲康唑對格特隱球菌VG II基因型的有效濃度分別為32μg/mL和0.5μg/mL，顯著高于新型隱球菌VN I基因型（分別為8μg/mL和0.25μg/mL）。一項國際共識研究發現，氟康唑對不同分子型的格特隱球菌的有效濃度不同：VG I、VG IIa和VG III為8mg/L；VG IV為16mg/L；VG II為328mg/L。盡管缺乏隨機試驗，越來越多的臨床經驗以及流行病學和微生物學數據支持在治療的持續階段使用廣譜咪唑類藥物。

抗真菌藥物治療的同時需要更積極處理并發癥。顱內壓升高與不良預后有關，因此預防顱內壓升高引起的繼發性腦損傷是治療的一個焦點，需要在抗真菌藥物治療的同時進行腦脊液引流降低顱內壓。常用方法包括：反復腰穿引流、置管持續外引流（分為側腦室引流和腰大池置管引流）、Ommaya囊植入引流術和腦室-腹腔分流術。顱內壓升高的患者，尤其是癥狀持續或惡化時，即便腦脊液菌量增加、抗體滴度增高，也應盡早使用激素。而且接受激素治療患者的視力下降和失明的發生率有所降低。

4.2 預后免疫功能正常的隱球菌性腦膜炎患者中，格特隱球菌的預后比新型隱球菌差。加拿大不列顛哥倫比亞省在1999至2007年，共有218例（平均每年每百萬人中有5.8例）感染格特隱球菌，19例死于中樞神經系統疾病（病死率8.7%）。美國太平洋西北部在2004至2011年，約有100例感染格特隱球菌患者，病死率為33%。感染格特隱球菌免疫功能正常的患者通常在數周或數個月內表現為較輕的亞急性感染，可與其他感染性或非感染性疾病相混淆。診斷不及時可能導致預后不良。格特隱球菌還可引起癥狀較重的腦膜炎，導致患者的預后較差。格特隱球菌的不同基因型也與預后相關，VG I基因型的預后比VG II基因型差，而VG IIb基因型預后比VG IIa基因型差。

5、結論

與新型隱球菌性腦膜炎比較，中國格特隱球菌性腦膜炎發病率較低，但近年來隨著格特隱球菌檢測方法的應用，發病率不斷增高，臨床對其認識尚不足。大部分醫院缺乏隱球菌分型檢測設備，無法快速獲得分型診斷以指導臨床診療。因此，重視了解格特隱球菌性腦膜炎的臨床特征、實驗室檢測、診斷和治療極有必要。

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