脾細(xì)胞及骨髓瘤細(xì)胞制備操作步驟

 準(zhǔn)備：

培養(yǎng)基A：RPMI1640 + 2mmol/L 谷氨酰胺+ 1mmol/L丙酮酸鈉+ 1 mmol/L非必需氨基酸+青霉素100U/ml, 鏈霉素100 µg/ml（有的實(shí)驗(yàn)室也加入10%NCTC109 培養(yǎng)基）

培養(yǎng)基B：培養(yǎng)基A +3% FCS （見后說明）

培養(yǎng)基C：培養(yǎng)基A + 1× HAT + 20% FCS（500ml）

50 × HAT液或粉劑（有商品）

PEG1500 （有商品，可即用）

1mol/L硫酸銅液

17mol/L NH4Cl 水溶液（消毒，用于紅細(xì)胞溶解）

培養(yǎng)皿（直徑100或60mm）

細(xì)胞粗濾器（篩孔：40 µm ）

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骨髓瘤細(xì)胞必須培養(yǎng)至少一周，要求在融合日要達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。所有的實(shí)驗(yàn)操作均需在消毒條件下進(jìn)行。

脾細(xì)胞制備

1．分離取出脾臟，置于含7ml培養(yǎng)基B的培養(yǎng)皿中（在動(dòng)物房進(jìn)行），將培養(yǎng)皿移入垂直氣流的通風(fēng)櫥中；

2．將脾臟移入另一含7ml培養(yǎng)基A的培養(yǎng)皿中，用鑷子撕開脾臟，使大多數(shù)脾細(xì)胞釋出；

3．用吸管吹打細(xì)胞團(tuán)塊，將混合液移入50ml聚丙乙烯管中，4℃沉降5min；

4．將細(xì)胞懸液移入另一50ml聚丙乙烯管， 200 × g 離心7min，棄上清；

5．用冰冷的0.17mol/L NH4Cl 水溶液（2-3ml/ 每個(gè)脾臟）懸起沉淀，在室溫下培養(yǎng)5-10 min，以溶解紅細(xì)胞，然后緩慢加入45ml培養(yǎng)基A；

6．200 × g 離心7min，棄上清；

7．沉淀再懸入10ml 培養(yǎng)基A中。

骨髓瘤細(xì)胞的制備

1．在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期收獲107-108的骨髓瘤細(xì)胞；

2．200 × g 離心7min，棄上清；

3．輕輕震動(dòng)試管以松動(dòng)沉淀，將細(xì)胞懸于20ml 培養(yǎng)基A中；

4．200 × g 離心7min，棄上清；

5．細(xì)胞懸于10 ml 培養(yǎng)基A中，取適量進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；

6．200 × g 離心7min，棄上清；

7．沉淀再懸于10 ml 培養(yǎng)基A中。

通過細(xì)胞融合得到B細(xì)胞雜交瘤

1．以2：1混合脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞；

2．加入培養(yǎng)基A到25ml；

3．在室溫下，200 × g 離心7min，棄上清；

4．輕輕震動(dòng)試管使松動(dòng)沉淀，后置入37℃水浴；

5．用1000µl的加樣器，緩慢（超過1min）逐滴加入700µl經(jīng)37℃預(yù)溫的PEG1500，并用吸頭攪拌；

6．經(jīng)過1 min后，緩慢（超過3min）加入5ml培養(yǎng)基A；

7．再過1 min ，加入7ml 37℃預(yù)溫的培養(yǎng)基A；

8．隔1 min，再加入7ml 37℃預(yù)溫的培養(yǎng)基A（以達(dá)逐步稀釋）；

9．室溫下，200 × g 離心10min，棄上清；

10．再將沉淀小心地懸浮于培養(yǎng)基C，使細(xì)胞終濃度為1 × 106 脾細(xì)胞/ml；

11．在已加100 µl培養(yǎng)基C/孔的2-3塊96孔板中，再加入100 µl/ 孔細(xì)胞懸液；

12．置入含5-8%CO2的37℃培養(yǎng)箱中；

13．一周后，每孔吸出100 µl上清，再加入100 µl培養(yǎng)基C，繼續(xù)每周換液1-2次；

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