實驗十七 細菌、放線菌、酵母菌、霉菌的菌落觀察和細菌菌落制片

一、墓本原理
　　菌落形態是指某種微生物在一定的培養基上由單個菌體形成的群體形態。細菌、放線菌、酵母菌和霉菌，每一類微生物在一定培養條件下形成的菌落各具有某些相對的特征，利用觀察這些特征，來區分各大類微生物及初步識別、鑒定微生物，方法簡便快速，在科研和生產實踐中常被采用。
　　利用血液培養基富有營養及粘性等特性來培養細菌，在此培養基上生長的菌落在固定時粘性很大，能夠牢固地附著在載玻片或蓋玻片上，便于制片和觀察。另外，血液培養基又是較好的保存菌種用培養基，故由此培養基所制的菌落制片能保存較長時間。
二、器材
　　圓褐固氮菌，枯草芽孢桿菌，灰色鏈霉菌，釀酒酵母，青霉的單個菌落平板，白色葡萄球菌（Staphylococcus albus）；
　　Bouin氏固定液，0．01％結晶紫溶液，羊血或兔血，肉膏蛋白胨瓊脂培養基，酒精等。
三、操作步驟
　　1．觀察圓褐固氮菌、枯草芽孢桿菌、灰色鏈霉菌、釀酒酵母、青霉的單個菌落特征，并按實驗一菌落特征描述的方法記錄結果。
　　2．血液瓊脂培養基的制備：
　?。?）成分pH7．6肉膏蛋白胨瓊脂培養基10ml，無菌脫纖維羊血（或兔血）1ml。
　?。?）將肉膏蛋白胨瓊脂培養基加熱溶化。
　　（3）待冷至45℃時，以無菌操作加1ml無菌脫纖維羊血于培養基內，立即搖蕩使血液和瓊脂培養基充分混勻。
　?。?）迅速以無菌操作倒入平板，使成血液瓊脂平板，注意不要產生氣泡。
　　（5）置37℃過夜，如無菌生長即可使用。
　?。?）將無菌的平板取出進行劃線接種分離單個菌落，因要保持瓊脂表面完整，接種改用圓頭光滑玻棒，注意不要把瓊脂劃破。接種后，倒置于37℃溫室中培養，次日觀察結果。如有單獨菌落出現，即可進行下項實驗。
　　3．細菌菌落制片
　　（1）細菌菌落印取選擇一個較小的單獨菌落，用小刀將菌落周圍約10—15mm的正方瓊脂切下，將此瓊脂塊上長有菌落的一面朝下，輕放在蓋玻片上，然后連同瓊脂塊將蓋玻片小心放于Bouin氏固定液中約1小時，直至瓊脂*變為白色后取出，將瓊脂小心剝去，剝時注意勿損傷菌落，僅使菌落留下，附著在蓋玻片上。
　?。?）用細水流輕輕沖洗附有菌落的蓋玻片。
　?。?）用0．01％結晶紫染液染色3分鐘后水洗，吸干。
　?。?）脫水將蓋玻片置于由低濃度到高濃度的酒精中（35％、50％、60％、70％、80％、95％、100％）各5分鐘，但在100％酒精中浸15分鐘。
　　（5）透明取出經過脫水的蓋玻片，再放入二甲苯中2分鐘。
　?。?）封固從二甲苯中取出蓋玻片，用軟紙拭去菌落周圍的二甲苯。隨即加一小滴加拿大乳膠于一潔凈載玻片的*，迅速反轉蓋玻片，輕輕地放在載玻片上，使加拿大乳膠鋪滿蓋玻片，注意不要產生氣泡，如果有氣泡即輕輕壓出。用低倍顯微鏡觀察其菌落特征。待乳膠*干燥，一二天后裝木匣內保存。
四、實驗報告