分光光度計的原理和分類

一.分光光度計的一般原理：

分光光度計是利用分光光度法，通過測定被測物質在特定波長處或一定波長范圍內光的吸收度，對該物質進行定性和定量分析。

不同種類的分光光度計的基本原理相似，都是利用一個可以產生多個波長的光源，通過系列分光裝置，從而產生特定波長的光源。光源透過測試的樣品后，部分光源被吸收，通過測量樣品的吸光值，經過計算可以轉化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。

二.分光光度計有哪些不同的類型，不同種類的應用領域的區別：

分光光度計有哪幾種不同的分類方式：

1.分光光度計按照波長及應用領域的不同可以分為：

(1)可見光分光光度計：測定波長范圍為400～760 nm的可見光區；

(2)紫外分光光度計：測定波長范圍為200～400nm的紫外光區；

(3)紅外分光光度計：測定波長范圍為大于760nm的紅外光區；

(4)熒光分光光度計：用于掃描液相熒光標記物所發出的熒光光譜；

(5)原子吸收分光光度計：光源發出被測的特征光譜輻射，被經過原子化器后的樣品蒸氣中的待測元素基態原子所吸收，通過測定特征輻射被吸收的大小，來求出被測元素的含量。

2.分光光度計按自動化程度分類：可分為手動、半自動、自動分光光度計。

3.分光光度計按軟件可分為：帶掃描、不帶掃描。

三.分光光度計常見的用途：

1.核酸的定量

核酸的高吸收峰的吸收波長260 nm。利用260nm的波長可以定量測量溶于緩沖液的寡核苷酸，單鏈、雙鏈DNA，以及RNA的濃度。

除了核酸濃度，分光光度計同時顯示幾個非常重要的比值表示樣品的純度。如A260/A280的比值，用于評估樣品的純度，因為蛋白的吸收峰是280nm。純凈的樣品，比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白質或者酚類物質的影響。

A230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0。

A320檢測溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品，A320一般是0。

2.蛋白質的直接定量

這種方法是在280nm波長，直接測試蛋白。選擇Warburg 公式，光度計可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應的換算方法，將吸光值轉換為樣品濃度。

3.細菌細胞密度

細菌培養過程中，需要采用分光光度計準確測定細菌細胞密度。

OD600是追蹤液體培養物中微生物生長的標準方法。在600nm波長下，以未加菌液的培養液作為空白液，測量定量培養后的含菌培養液。

四.幾種常見的分光光度計的用途的區別：

(1)可見分光光度計

用來測量待測物質對可見光(400～760nm)的吸光度并進行定量分析的儀器，稱為可見分光光度計?？稍?00nm測定細菌細胞密度。

(2)紫外可見分光光度計

紫外可見光譜儀用來測量待測物質對可見光或紫外光(200～760nm)的吸光度并進行定量分析的儀器?？梢詼y定核酸和蛋白的濃度，也可以測定細菌細胞密度。

紫外分光光度計又可分為單光束,假雙光束,雙光束。它們的用途又有區別。

單光束：適于在給定波長處測量吸光度或透光度，一般不能作全波段光譜掃描，要求光源和檢測器具有很高的穩定性。

雙光束：自動記錄，快速全波段掃描?？上庠床环€定、檢測器靈敏度變化等因素的影響，特別適合于結構分析。儀器復雜，價格較高。

假雙光束也就是比例雙光束，它的原理是由同一單色器發出的光被分成兩束，一束直接到達檢測器，另一束通過樣品后到達另一個檢測器。這種儀器的優點是可以監測光源變化帶來的誤差，但是并不能消除參比造成的影響。

(3)紅外分光光度計

一般的紅外光譜是指大于760nm的紅外光譜，這是研究有機化合物常用的光譜區域，能分析各種狀態(氣、液、固)的試樣。

紅外光譜法的特點是：快速、樣品量少(幾微克-幾毫克)，特征性強(各種物質有其特定的紅外光譜圖)、能分析各種狀態(氣、液、固)的試樣以及不破壞樣品。

(4)熒光分光光度計

熒光分光光度計是用于掃描液相熒光標記物所發出的熒光光譜的一種儀器。應用于科研、化工、醫藥、生化、環保以及臨床檢驗、食品檢驗、教學實驗等領域。

通過對這些參數的測定, 不但可以做一般的定量分析，而且還可以推斷分子在各種環境下的構象變化，從而闡明分子結構與功能之間的關系。

(5)原子吸收分光光度計

該法主要適用樣品中微量及痕量組分分析常規儀器之一。是材料分析及質量控制部門進行常量、微量金屬(半金屬)元素分析的有力工具。