蛋白質分析技術(Western Blot、ELISA、免疫熒光與免疫組化技術)

1 原理：
將通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質轉移到硝酸纖維素或PVDF膜上，然后與能特異性識別待檢蛋白的抗體進行反應，洗滌去除沒有結合的特異性抗體后，加入標記的、能識別特異性抗體的種屬特異性抗體，反應一段時間后再次洗滌去除非特異性結合的標記抗體，加入適合標記物的檢測試劑進行顯色或發光等，觀察有無特異性蛋白條帶的出現，也可通過條帶的密度大小來進行特異性蛋白的半定量。

2 操作過程
SDS-PAGE電泳→轉膜（PVDF或硝酸纖維素膜）
封閉→一抗→洗滌→酶標二抗反應
洗滌→顯色或化學發光顯影


Western blot analysis of the cleavage of Caspase-3. IM9/Bcl-2 Cells were treated with 20mM of gossypol for 4, 8
and 16 h. After treatment, cells were harvestedlysed in lysis buffer. 50ug of protein was loaded in each lanethe expression of actin was detected as a loading control.

Cytochrome c release from mitochondria to cytosol in gossypol-treated IM-9/Bcl-2 cells. Cells were treated with 10μM gossypol for different times, cytosolmitochondrial protein were subject to SDS-PAGE followed by immunoblot with cytochrome c specific antibody.


3 注意的問題
（1） 蛋白質電泳
常用SDS-PAGE：單一亞基組成的蛋白質
非變性PAGE：多個不同亞基組成的蛋白質
Tris-Tricine膠中電泳：用于分子量小于10kDa的多肽和蛋白的電泳，能夠獲得較好的分離效果。
（2）轉膜
戴手套，避免用手接觸濾紙、凝膠和膜，因為手上的油脂會阻斷轉印。濾紙和膜的尺寸與凝膠大小一致
以適量的轉移Buffer室溫平衡濾紙、凝膠和膜15－30min，如果是PVDF膜，必須先用甲醇激活后浸泡。
方向正確：凝膠在陰極，膜在陽極
排去濾紙、膠和膜間的氣泡。
電轉時間：100V 1-2h,可根據蛋白分子量的大小靈活 選擇轉移結束后，凝膠用考馬氏亮蘭染色以確定轉移效率膜用麗春紅染色觀察蛋白分子量標準的位置
（3）封閉
用5％脫脂奶粉或3％BSA
（含0.1％Tween20 TBS或PBS配制）
時間：室溫2h或4ºC過夜
（4）顯色或顯影
顯色
辣根過氧化物酶：底物為DAB
堿性磷酸酶：底物為BCIP/NBT
化學發光顯影
zui常用。辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶有不同的發光底物（商品化產品）
注意：化學發光前將膜用不含Tween20的TBS或PBS洗滌一次曝光的時間和顯影的時間根據實際情況而定
（5）膜的再利用
化學發光后的硝酸纖維素膜用Stripping －2ME ）Buffer洗滌后（洗滌Buffer: 62.5mm pH6.7 的Tris-HCI含2％SDS和100mm的 用不同的一抗進行雜交，檢測其它蛋白的表達情況。一張膜可以重復使用3－4次。堿性磷酸酶顯色的膜不能再進行雜交
二、ELISA
1 原理：
ELISA的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本與固相載體表面的抗原或抗體起反應。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應而結合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質的量呈一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據呈色的深淺進行定性或定量分析。測定方法具有很高的敏感度（pg-ng/ml水平），并且重復性好。
ELISA 常用的酶和底物
辣根過氧化物酶，底物為OPD, 深桔黃色 ，檢測波長492nm
TMB， 藍綠色，檢測波長450nm
堿性磷酸酶，底物為PNPP（對－消基苯磷酸酯）, 黃色
檢測波長405nm
ELISA各步驟的反應時間
包被：24－36h，蛋白濃度為1－5ug/ml
封閉：37ºC 2h 或4ºC過夜（3％BSA）
樣本反應時間：37ºC 45min-1h
酶標抗體反應時間： 37ºC 45min-1h
顯色時間：15min(避光）
設對照
可以一次包被多塊板，凍存備用
2 類型
（1）間接法測抗體
間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標記的抗抗體，檢測與固相抗原結合的受檢抗體，故稱為間接法。
常用于臨床血清中自身抗體的檢測，以及雜交瘤上清特異性抗體的篩選。如血清中PDCD5自身抗體的檢測。


(2) 雙抗體夾心法測抗原
是檢測抗原zui常用的方法。
只要獲得針對受檢抗原的特異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結合物。
常用的組合：單克隆抗體＋多克隆抗體
單克隆抗體＋單克隆抗體
后一組合是兩種單克隆抗體針對抗原上不同的相距較遠的兩個抗原決定簇，分別用于包被固相載體和制備酶結合物。
用途：測定二價或二價以上的大分子抗原，但不適用于測定半抗原及小分子單價抗原，因其不能形成兩位點夾心。例如各種細胞因子的檢測。

雙抗體夾心法測抗原的方法：
捕獲抗體包被→封閉（3％BSA）→待測抗原→洗滌（含0.1％Tween的PBS)→酶標單抗或多抗→洗滌→顯色→檢測
(3)競爭法測抗原
1）抗體固相測抗原 小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個以上的位點，因此不能用雙抗體夾心法進行測定，可以采用競爭法模式。
其原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結合。標本中抗原量含量愈多，結合在固相上的酶標抗原愈少，zui后的顯色也愈淺。
方法：抗體包被→封閉→同時加入待測抗原和酶標抗原→洗滌→酶底物→顯色→ELISA reader檢測
2）抗原固相測抗原
其原理是標本中的抗原和固相抗原與一定量的抗體競爭結合。標本中抗原含量愈多，結合在固相上的抗體愈少，zui后的顯色也愈淺。
方法:
a: 抗原包被96孔板； b:封閉;
c: 待測抗原與抗體反應一定時間； d: 加入96孔板
e: 洗滌 f：加入酶標二抗
g：洗滌 h：顯色和檢測

（4）IgM抗體的檢測
1）間接法：
間接法ELISA一般僅適用于檢測總抗體或IgG抗體。如用抗原包被的間接法直接測定血清中的IgM抗體，因標本中一般同時存在較高濃度的IgG抗體，后者將競爭結合固相抗原而使一部分IgM抗體不能結合到固相上，將出現假陰性結果。 因此，如果用抗IgM作為二抗，間接測定IgM抗體，必須先將標本用A蛋白或抗IgG抗體處理，以除去IgG的干擾。
 

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