標記定量蛋白組學

標記定量蛋白組學檢測技術(shù)服務(wù)詳情介紹

隨著蛋白質(zhì)組學的發(fā)展，jǐnxiàn于對蛋白質(zhì)類型及修飾的定性分析已無法滿足科研需求。在此情況下，定量蛋白質(zhì)組學技術(shù)應(yīng)運而生，成為近年來生命科學的研究熱點之一。蛋白質(zhì)組學的定量技術(shù)是在已知蛋白類型的基礎(chǔ)上，結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)給出的信號強度對其表達量及豐度進行定量，可分為靶向和非靶向。其中靶向定量技術(shù)包括多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM）技術(shù)和平行反應(yīng)監(jiān)測（PRM）技術(shù)，非靶向定量技術(shù)根據(jù)有無標記可分為非標記定量和標記定量技術(shù)，這里主要介紹標記定量技術(shù)。

標記定量的主要策略是向不同蛋白質(zhì)或多肽樣品中引入具有穩(wěn)定同位素標記的小分子，通過同位素標記后所產(chǎn)生的質(zhì)量差來識別肽段的來源。在同一次質(zhì)譜掃描中化學性質(zhì)相同的標記肽段離子化效率和碎裂模式也相同，因此比較不同的同位素標記物的信號強度就可以計算出不同樣品中蛋白質(zhì)的相對含量。根據(jù)引入同位素標記方式的不同，又可分為體內(nèi)標記和體外標記兩類。

圖1 定量蛋白質(zhì)組學技術(shù)分類圖

1、體內(nèi)標記定量

體內(nèi)標記也可以稱為新陳代謝標記。穩(wěn)定同位素氨基酸細胞培養(yǎng)技術(shù)（SILAC）是zuì經(jīng)典的體內(nèi)標記定量技術(shù)，該技術(shù)的基本原理是將輕、重同位素標記的必需氨基酸（通常為賴氨酸和jīngānsuān）分別加入到細胞培養(yǎng)基中，經(jīng)過5-6 個倍增周期，細胞內(nèi)新合成的蛋白質(zhì)氨基酸幾乎wánquán被穩(wěn)定同位素標記，根據(jù)混合樣品中兩種同位素標記肽段呈現(xiàn)的峰強度或面積比例即可實現(xiàn)對蛋白質(zhì)的jīngquè定量。

優(yōu)點：標記過程與活細胞的代謝過程相結(jié)合，能夠更真實地反映生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)表達情況，且無需對蛋白質(zhì)進行分離純化，避免了因分離步驟而引入的誤差。•

缺點：標記效率可能受到細胞代謝狀態(tài)的影響，且標記過程易受其他代謝途徑的干擾。•

圖2 SILAC的工作流程

2、體外標記定量

基于代謝反應(yīng)的體內(nèi)標記定量技術(shù)存在著耗時長、價格貴等問題，因而發(fā)展出一系列體外標記定量技術(shù)，其中在樣品處理后期進行酶促標記和化學標記是當前研究的重點。

2.1酶促標記技術(shù)

這種技術(shù)通過yídànbáiméi的催化作用將一組樣品的肽段C末端16O原子替換成18O，從而使兩組樣品產(chǎn)生分子量的差異，通過比較標記肽段和未標記肽段的峰面積，即可對蛋白樣本進行定量。

優(yōu)點：反應(yīng)條件溫和，區(qū)域?qū)Ｒ恍愿撸也僮骱啽悖瑑r格低廉。•

缺點：標記穩(wěn)定性差，重復性不好，分辨率較低。•

2.2化學標記技術(shù)

化學標記是目前蛋白質(zhì)組學領(lǐng)域中應(yīng)用zuì廣泛的定量方法，它不會受到樣品來源的限制，并且可以根據(jù)肽段或者蛋白分子上不同的反應(yīng)基團設(shè)計不同的化學反應(yīng)，實現(xiàn)肽段和蛋白的定量。根據(jù)反應(yīng)基團的不同，化學標記可以分為疏基標記、氨基標記和梭基標記等。其中zuì常用的是基于氨基標記的同位素標記相對和juéduì定量（iTRAQ）和串聯(lián)質(zhì)量標簽（TMT）技術(shù)。

特點：標記過程可控性強，可靈活選擇標記物和標記物質(zhì)，jīngquè度和準確性高。•

缺點：依賴化學反應(yīng)、受環(huán)境影響較大，且標記過程可能引入誤差，對操作人員技術(shù)要求較高。•

圖3 iTRAQ/TMT技術(shù)的工作流程

蛋白質(zhì)標記定量在生物醫(yī)學研究、藥物開發(fā)、疾病診斷等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用，特別是在研究蛋白質(zhì)如何在不同條件下表達和調(diào)控方面。以上幾種標記方法在蛋白質(zhì)定量組學中各有優(yōu)劣，在選擇標記方法時，需要根據(jù)具體的研究需求、實驗條件以及樣本特性進行綜合考慮。

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