轉(zhuǎn)基因水稻檢測儀器的樣本前處理方法

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　　樣本采集與保存

　　采集：根據(jù)檢測目的確定采樣部位。若檢測水稻種子，要確保種子無霉變、蟲蛀，隨機(jī)選取一定數(shù)量的種子，一般不少于 100 粒，以保證樣本的代表性。對(duì)于水稻植株，可采集葉片，選取生長良好、無病蟲害的葉片，用干凈剪刀剪取適量，一般每份樣本采集 1 - 2 克葉片。

　　保存：采集后的樣本需及時(shí)處理。若不能立即處理，種子可置于干燥、陰涼處保存，避免受潮;葉片樣本可放入自封袋中，排除空氣后密封，放入冰箱冷藏(4℃左右)，保存時(shí)間不宜超過 3 天，以防核酸降解。

　　樣本研磨

　　設(shè)備選擇：可使用研缽和研杵手動(dòng)研磨，也可選用組織研磨儀等電動(dòng)設(shè)備。手動(dòng)研磨適合少量樣本，操作簡單但效率較低;組織研磨儀能同時(shí)處理多個(gè)樣本，效率高且研磨效果均勻。

　　操作步驟：將樣本放入研缽或研磨儀的研磨管中，加入適量的液氮(液氮可使樣本迅速冷凍，便于研磨)。若用手動(dòng)研缽，用研杵快速研磨樣本，直至呈粉末狀;若用組織研磨儀，設(shè)置合適的研磨時(shí)間和頻率，一般研磨時(shí)間為 1 - 3 分鐘，頻率為 20 - 30 次/秒，研磨完成后樣本也應(yīng)呈均勻粉末狀。

　　核酸提取

　　試劑選擇：常用的核酸提取試劑有 CTAB 法試劑盒、磁珠法試劑盒等。CTAB 法試劑盒成本較低，但操作步驟相對(duì)復(fù)雜;磁珠法試劑盒操作簡便、快速，且提取的核酸純度較高。

　　操作流程：以 CTAB 法為例，將研磨好的樣本粉末轉(zhuǎn)移至離心管中，加入 CTAB 提取液，65℃水浴 30 - 60 分鐘，期間不時(shí)顛倒混勻。水浴后加入氯仿 - 異戊醇(24:1)，輕輕顛倒混勻，12000 rpm 離心 10 - 15 分鐘。取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入異丙醇，輕輕顛倒混勻，-20℃沉淀 30 分鐘以上。12000 rpm 離心 10 分鐘，棄上清，用 75%乙醇洗滌沉淀 2 次，晾干后加入適量的 TE 緩沖液溶解核酸。

　　核酸純化與濃度測定

　　純化：可使用乙醇沉淀、柱純化等方法進(jìn)一步純化核酸。乙醇沉淀可去除殘留的鹽離子和小分子雜質(zhì);柱純化則利用特定的吸附柱，能高效去除雜質(zhì)，提高核酸的純度。

　　濃度測定：使用紫外分光光度計(jì)測定核酸的濃度和純度。一般核酸在 260 nm 處有最大吸收峰，通過測量 260 nm 和 280 nm 處的吸光度值，計(jì)算 A260/A280 的比值。比值在 1.8 - 2.0 之間說明核酸純度較高，可用于后續(xù)檢測。根據(jù)測定的濃度，將核酸稀釋至合適的濃度，一般轉(zhuǎn)基因水稻檢測中核酸濃度控制在 10 - 100 ng/μL。