1. 使用三重四級桿質譜進行蛋白藥物定量的方法開發流程

使用質譜進行蛋白藥物定量，在方法開發時主要考慮樣品前處理和質譜方法兩個主要方面。在前處理方面我們使用了去垢劑輔助沉淀酶解的方法來獲得更佳的酶解效率和更低的基質效應，具體步驟如圖1a所示。蛋白類藥物質譜定量時一般采用bottom-up的策略，因此整個質譜方法的開發主要包括候選肽段挑選，質譜參數優化（Compound Optimization）和離子對精簡（Re-nement）三個步驟（圖1b）。

● 候選肽段挑選

一般來說，我們挑選的候選肽段需要滿足以下條件: (1) 該肽段在基質樣品不存在*相同的序列，在實際工作中，這一步通常需要放到最后的re-nement步驟完成評估。(2) 肽段的長度在7-20個氨基酸為宜, 太短的肽段特異性較差，而太長的肽段通常色譜質譜行為不佳，給方法開發帶來困難。(3) 沒有漏切位點。(4) 不含M, C, KP/RP, HxS/T等氨基酸或者一致序列。(5) 該肽段質譜響應高。由于三重四級桿質譜儀不具備數據依賴采集（Data-dependent Acquisition, DDA）的功能來對蛋白藥物進行肽圖分析，因此在進行候選肽段挑選時通常依賴于軟件預測的方法[8]。然而軟件預測通常效率不可控，因此通常需要產生較多的候選肽段來進行后續的化合物優化和re-nement步驟，從而增加了方法開發的時間。

而在實驗室擁有高分辨質譜的情況下，我們可以大大簡化這一步驟。我們將目標單抗摻入BSA基質進行酶解，隨后采用Orbitrap質譜儀進行DDA的數據采集，生成的數據使用Proteome

DiscovererTM (PD) 2.3進行非標記定量（Label Free Quanti_cation, LFQ）分析，可以輕松的找到強度最高的肽段（圖1b）。隨后我們僅需選出不含漏切位點，不含M, C, KP/RP, HxS/T且長度合適的肽段即可。采用Orbitrap進行LFQ分析后，我們不僅可以獲得肽段的強度信息（圖2a, 2b），還

可以獲得每條肽段的注釋二級譜，幫助我們在挑選離子對時排除掉一些諸如中性丟失等選擇性差的離子對（圖2c）。

為了幫助我們在定量單抗藥物時更好的監控藥物在體內的結構完整性，我們在單抗恒定區的四個主要結構域均挑選了2-3條候選肽段來進行后面的優化和精選（圖3）。LSP2，HSP2和HSP8三條候選肽段均含有半胱氨酸殘基（圖3b,3c），在IAA處理后會形成烷基化的固定修飾，理論上不適合作為定量肽段，但為了保證每個結構域均有肽段能夠參與定量，我們依舊在優化和精選步驟將中它們計入考察。

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