8
嬰幼兒奶粉雙氰胺檢測——默克色譜柱快速解決方案
ZIC®-HILIC色譜柱快速檢測嬰幼兒奶粉中雙氰胺
默克密理博應用實驗室 2013-01-29
默克密理博應用實驗室 2013-01-29
1 前言
2013 年1 月，新西蘭牛奶及奶制品被檢測出含有低含量的有毒物質雙氰胺（二氰二氨Dicyanodiamide，DCD），已經下令禁售含有DCD的奶制品。中國的進口奶粉八成來自新西蘭，60%以上的奶源產自新西蘭。新西蘭奶農通常會在牧草上噴灑雙氰胺，防止肥料中的副產品硝酸鹽流入河流和湖泊。雙氰胺
目前，還沒有相應的食品含量標準和檢測標準。默克密理博致力于分析方法的開發，為客戶提供簡便、快速的解決方案。雙氰胺極性較強，易溶于水，中性及酸性條件下易電離，適合使用默克密理博的兩性離子型親水作用（ZIC®-HILIC）色譜柱分離。同時，雙氰胺在218nm下有強紫外吸收，可以采用ZIC®-HILIC 色譜柱在HPLC-UV條件進行快速分析，亦可在LC-MS/MS進行痕量檢測。
2 儀器及試劑
2.1 儀器設備
2.1.1 色譜柱：ZIC®-HILIC, PEEK HPLC Column 250 x 4.6 mm, 5 μm, 200 Å（1.50458.0001）2.1.2 HPLC：Agilent 1260HPLC（DAD檢測器）
2.1.3 單道移液器Transferpette®S，Digital adjustable 500-5000ul（Brand：BR704782）
2.1.4 微孔濾膜:0.45um,PTFE（Millipore：SLFHX13NL）
2.1.5 純水系統:Milli-Q3（Millipore）
2.1.6 PP離心管：50mL,帶蓋，含底座（貨號:114822BR）
2.2 試劑
2.2.1 色譜乙腈:LichroSolv®Acetonitrile Gradient Grade（1.00030.4008）2.2.2 乙酸銨：Ammonium acetate for analysis EMSURE® ACS,Reag. Ph Eur（1.01116.1000）
2.2.3 甲酸：Formic acid 98-100% for analysis EMSURE® ACS,Reag. Ph Eur（1.00264.1000）
2.2.4 2%甲酸溶液：取20ml甲酸，加入1000ml超純水中
2.2.5 乙腈-甲酸溶液：取700ml乙腈（2.2.1）,與300ml 甲酸溶液（2.2.4）混合
3 實驗方法
3.1 樣品處理
方法1:取嬰幼兒配方奶粉2g于50mL PP管（2.1.6）中，加18mL 2%的甲酸水溶液，加蓋密閉。搖振60秒，再超聲30分鐘，取出，再搖振60秒，放入離心機中離心（4000轉），20分鐘。取出，吸取上清液50ul，于10ml PP管中，加入950ul乙腈，加蓋密閉，振搖60秒，吸取溶液，過濾，即得供試液。
方法2：
取嬰幼兒配方奶粉2g于50mL PP管中，加20mL 乙腈-甲酸水溶液（2.2.4），加蓋密閉。搖振60秒，再超聲30分鐘，取出，再搖振60秒，靜置，吸取上層溶液，過濾，即得供試液。
加標樣品同法配制。
3.2 測試條件
3.2.1 色譜條件流動相 （v/v）: A-醋酸銨溶液（10 mM）,B-乙腈
比例*：A:B=12：88
流速:1 mL/min
進樣量：20ul
*必要時設置如下方法對色譜柱進行再生和平衡：
| 時間，min | % | % | 流速 ml/min | |
| 0 | 12 | 88 | 1 | 等度 |
| 10 | 12 | 88 | 1 | 等度 |
| 10.5 | 30 | 70 | 2 | 再生 |
| 15 | 30 | 70 | 2 | 再生 |
| 15.1 | 12 | 88 | 2 | 平衡 |
| 20 | 2 | 88 | 2 | 平衡 |
3.3 測試結果
按照方法1處理，結果如下：
3.3.1 對照品圖譜
圖1 對照品圖譜（DCD濃度1.25ug/ml）
雙氰胺保留時間4.98min,理論塔板數13086,拖尾因子1.1.
3.3.2 無檢出的奶粉空白
圖2 配方奶粉空白
圖3 奶粉加標（測試液中加入的標樣濃度:5ug/ml）
圖4 奶粉加標（測試液中加入的標樣濃度：0.05ug/ml）
圖4 奶粉加標（測試液中加入的標樣濃度：0.05ug/ml）
3.3.4 某奶粉
圖5 某進口奶源的奶粉圖譜
該品牌奶粉中未檢出雙氰胺.
4 結論
采用ZIC®-HILIC色譜柱，可用于雙氰胺的快速檢測。處理方法簡單，色譜峰型良好，方法重現性良好（RSD<2%）,檢測濃度在0.5-10ug/ml之間現行關系良好（R=0.999）,加樣回收率在95.6-101.5%之間。按照方法1的處理，LOD為1.3ug/g奶粉，按照方法二處理,LOD可達0.07ug/g。該色譜柱還能用于三聚氰胺、雙氰胺、三聚氰酸、二甲雙胍、尿素等的同時檢測，如：
色譜柱：ZIC®-HILIC （5 µm, 200Å） PEEK 150x2.1 mm
流動相：A: 95:5 ACN:0.1% formic acid/10 mM ammonium formate in H2O
B: 50:50 ACN:0.1% formic acid/10 mM ammonium formate in H2O
梯度方法
| Time （min） | Solution A （%） | Solution B （%） | Flow rate （mL/min） | Elution |
| 0.0-5.0 | 100 | 0 | 0.400 | isocratic |
| 5.0-12.8 | 100-25 | 0-75 | 0.400 | gradient |
| 12.8-15.8 | 25 | 75 | 0.400 | isocratic |
| 15.8-16.0 | 100 | 0 | 0.400 | equilibration |
| 16.0-24.9 | 100 | 0 | 0.600 | equilibration |
| 24.9-25.0 | 100 | 0 | 0.400 | equilibration |
詳細方法可參考：
- FDA Laboratory Information Bulletin 4487
- Journal of Chromatography A 1220 （2012） 101–107
更多詳情，請默克密理博實驗室基礎業務