雙氰胺極性較強，易溶于水，中性及酸性條件下易電離，適合使用默克密理博的兩性離子型親水作用（ZIC®-HILIC）色譜柱分離。FDA 在Bulletin 4487中采用ZIC®-HILIC色譜柱，建立了測定乳品、蛋白質等基質的樣品中包括雙氰胺在內的LC-MS/MS測試方法，現把該方法樣品處理及檢測條件簡要列出。
 
同時默克密理博致力于分析方法的開發，為客戶提供簡便、快速的解決方案，我們采用ZIC®-HILIC 色譜柱在HPLC-UV條件進行了摸索，為客戶提供快速簡便的測試方法。
 
默克密理博雙氰胺檢測柱

應用	規格描述	貨號
HPLC	ZIC®-HILIC （5 µm, 200Å） PEEK HPLC Column 250 x 4.6 mm	1.50458.0001
LC-MS/MS	ZIC®-HILIC （5 µm, 200Å） PEEK 150x2.1 mm	1.50454.0001

 
LC-MS/MS檢測嬰幼兒奶粉中雙氰胺（FDA Bulletin 4487）
 
FDA #4487方法^[1]中建立了同時檢測奶粉及高蛋白產品中可能存在添加的六種含氮物質（環丙氨嗪、雙氰胺、尿素、縮二脲、三縮脲、脲基甲脒）分析方法。方法中采用2%的甲酸水溶液提取，再加入乙腈進行蛋白沉淀。提取物使用默克密理博的ZIC®-HILIC色譜柱在液質聯用（LC-MS/MS）儀器上分析，在脫脂奶粉、奶粉、大豆蛋白、面粉、麥麩和谷物基質中進行標樣添加測試并進行了方法驗證，該方法測試雙氰胺 Dicyandiamide （DCD）的平均回收率為 98.1% ，RSD=5.6%，在脫脂奶粉中測試的檢測限（LOD）為20ppb，定量限為60ppb.
 
 

LC-MS樣品處理方法^[1-2]

1.稱取一定量的奶粉，加10倍溫水溶解，得奶粉母液樣品。稱取奶粉母液樣品（2.0±0.02g）于50ml PP管中，方法空白樣品量取2.0ml水；
2.方法摸索的樣品可在PP管中加入相當于1ppm的雙氰胺對照品；.校準曲線用的樣品可在樣品管中分別添加相當于0.8-8.0ppm的雙氰胺對照品；
3.每根PP管中加入18mL 2%的甲酸水溶液，振搖60秒，使所有固型物分散開。為了方便快速移取溶液，可設置5.0mL的移液器量程到4.5mL，連續移取4次即得18mL。加入提取液的PP管超聲30分鐘，再振搖1分鐘，放入離心機中離心20分鐘（4500rpm）。
4.移取離心后的上清液50ul，于1.5ml離心管中，加入950ul乙腈。在加入乙腈后，會有白色沉淀，可適當振搖30秒，再放入離心機中離心10分鐘。離心后，吸取上清液，用0.20um PTFE膜過濾至2ml自動進樣瓶中。必要時可取濾液100ul，加入500ul的乙腈-2%甲酸水溶液（95/5）稀釋后再進行測試。
 
 

測試條件

色譜條件
色譜柱：ZIC®-HILIC （5 µm, 200Å） PEEK 150x2.1 mm（貨號:1.50454.0001）
流動相：A: 95:5 乙腈:0.1%甲酸水溶液（含10mM甲酸銨）
B: 50:50乙腈:0.1%甲酸水溶液（含10mM甲酸銨）
流動相比例：0-5min，100%A.
注:由于雙氰胺保留時間在3.4min左右，可在5分鐘內完成分析。無需運行文獻[2]的梯度程序。必要時，采用100%的B相機進行色譜柱的沖洗。
進樣量：2-5ul（FDA方法中采用20ul）
質譜條件
離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃；檢測方式：多反應檢測（MRM）；去簇電壓:36V；雙氰胺的分子離子[M+1]+ m/z:85.0,子離子m/z:68.0,43.1.
 

FDA方法測試結果

雙氰胺的保留時間tR=3.4min. 檢測限LOD=20ppm，定量限LOQ=60ppb,加標回收率在93-101%，低、高兩個濃度下的RSD值分別為5.9%和5.3%.

我們采用LC-MS的色譜柱（ZIC®-HILIC （5 µm, 200Å） PEEK 150x2.1 mm）在Agilent1260 HPLC上進行測試，218nm下的色譜圖如下：


雙氰胺保留時間3.1.3min，其中藍色-奶粉樣品；綠色-奶粉加標；紅色-雙氰胺對照品（1.25ug/ml）。流動相：95:5 乙腈:0.1%甲酸水溶液（含10mM乙酸銨），進樣量均為2ul.
 

HPLC方法檢測嬰幼兒奶粉中雙氰胺

為了方便HPLC的用戶，我們采用ZIC®-HILIC HPLC色譜柱開發了相應的檢測方法。

樣品前處理
取嬰幼兒配方奶粉2g于50mL PP管中，加18mL 2%的甲酸水溶液（2.2.4），加蓋密閉。搖振60秒，再超聲30分鐘，取出，再搖振60秒，放入離心機中離心（4000轉），20分鐘。取出，吸取上清液50ul，于10ml PP管中，加入950ul乙腈，加蓋密閉，振搖60秒，吸取溶液，過濾，即得供試液。
或取嬰幼兒配方奶粉2g于50mL PP管中，加20mL 乙腈-甲酸水溶液（2.2.4），加蓋密閉。搖振60秒，再超聲30分鐘，取出，再搖振60秒，靜置，吸取上層溶液，過濾，即得供試液。（快速處理方法）
加標樣品同法配制。樣品配置方法亦可采用LC-MS/MS的處理方法。

色譜條件
流動相 （v/v）: A-醋酸銨溶液（10 mM）,B-乙腈
比例*：A:B=12：88（必要時在方法中設置沖柱程序）
流速:1 mL/min
進樣量：20ul

測試結果

 

圖中藍色為標樣（1.25ug/ml）,綠色為奶粉空白，紅色為奶粉加標（加入量10ug/g）.

采用ZIC®-HILIC色譜柱，HPLC-UV下測試，無干擾，可用于雙氰胺的快速檢測。該方法處理方法簡單，色譜峰型良好，方法重現性良好（RSD<3%）,檢測濃度在0.5-10ug/ml之間現行關系良好（R=0.999）,加樣回收率在95.6-101.5%之間。按照方法1的處理，LOD為1.3ug/g奶粉，按照方法2處理,LOD可達0.07ug/g。

詳細方法可參考：

[1] FDA Laboratory Information Bulletin 4487（雙氰胺檢測方法）
[2]Journal of Chromatography A 1220 （2012） 101–107
[3]FDA Laboratory Information Bulletin 4421（三聚氰胺檢測方法）

其他相關詳細方法，請默克密理博。

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