一、分離純化的基本原理  

研究基因的表達和調控時常常要從組織和細胞中分離和純化RNA。RNA質量的高低常常影響cDNA庫，RT-PCR和Northern Blot等分子生物學實驗的成敗。Trizol是一種新型總RNA抽提試劑，內含異硫氰酸胍等物質，能迅速破碎細胞，抑制細胞釋放出的核酸酶。   

二、試劑和材料  

無水乙醇、氯fang、Glycogen（可能需要）、 1.5ml Eppendorf管（RNase-free）、 Tips（RNase-free）   

三、準備工作  

RNase酶非常穩定，是導致RNA降解zui主要的物質。它在一些的條件可以暫時失活，但限制因素去除后有迅速復性。用常規的高溫高壓蒸氣滅菌方法和蛋白抑制劑都不能是RNase*失活。它廣泛存在于人的皮膚上，因此，在與RNA制備有關的分子生物學實驗時，必須戴手套。  RNase的又一污染源是取液器，根據取液器制造商的要求對取液器進行處理。一般情況下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的內部和外部，基本達到要求。取RNase-free的物品時必須戴手套。  

1、 料制品的處理   盡可能使用無菌，一次性塑料制品，已標明RNase-Free 的塑料制品，如沒有開封使用過通常沒有必要再次處理。對于國產塑料制品，原則上都必須處理方可使用。

處理步驟如下：   
1）在玻璃燒杯中注入去離子水，加入DEPC使DEPC的終濃度為0.1%。注意：DEPC為劇毒物，活性很強，小心在通風柜中使用。  
2）處理的塑料制品放入一個可以高溫滅菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。  

3）在通風柜中室溫處理過夜。  
4）將DEPC水溶液小心倒到廢液瓶中，用鋁箔封住含已DEPC水處理過的塑料制品的燒杯，高溫高壓蒸氣滅菌至少30分鐘。  

5）烘箱用合適的溫度烘拷至干燥。置于干凈處備用。  

2、 璃玻和金屬物品   250°C烘烤3小時以上。  

四、從組織中提取總RNA  

1)液氮研磨：組織塊直接放入研缽中，加入少量液氮，迅速研磨，待組織變軟，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50-100mg組織/ml Trizol加入Trizol，轉入離心管進行第2步操作。   
2) 勻漿：組織樣品按50-100mg/mlTrizol 加入Trizol。另外，組織體積不能超過Trizol體積的10%，否則勻漿效果會不好，用電動勻漿器充分勻漿約需1-2分鐘。   

五、從細胞中提取總RNA  
1) 培養貼壁細胞：不須消化，可直接用Trizol進行消化、裂解，Trizol
體積按10cm2
/ml比例加入。  
2) 懸浮細胞可直接收集、裂解，每1ml Trizol可裂解5×10 6動物、植物或酵母細胞，或10 7細菌細胞。   

六、操作步驟  
1、細胞或組織加Trizol后，室溫放置5min，使其充分裂解。注：此時可放入-70℃長期保持。  
2、12,000rpm 離心5min，棄沉淀。  
3、按200ul氯fang/ml Trizol加入氯fang，振蕩混勻后室溫放置15min。注：禁用漩渦振蕩器，以免基因組DNA斷裂。  

4、4℃ 12,000g離心15min。  
5、吸取上層水相，至另一離心管中。注：千萬不要吸取中間界面；若同時提取DNA和蛋白質，則保留下層酚相存于4℃冰箱,若只提RNA，則棄下層酚相。  
6、按0.5ml異丙醇/ml Trizol 加入異丙醇混勻，室溫放置5-10min。

7、4℃ 12,000g離心10min，棄上清，RNA沉于管底。  
8、按1ml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。  
9、 4℃ 8,000g離心5min，盡量棄上清。  
10、室溫晾干或真空干燥5-10min。 注：RNA樣品不要過于干燥，否則很難溶解。

11、可用50ul H2O，TE buffer或0.5%SDS溶解RNA樣品，55-60℃,5-10min。

注：H2O、TE或0.5%SDS均須用DEPC處理并高壓。  

12、測O.D值定量RNA濃度。注：此方法提取RNA A260/A280值在1.6-1.8之間；產率估計：組織標本：（ug RNA/mg組織）1-10ug，培養細胞（ug RNA/10 6 Cell）：5-15ug。 
注：組織或細胞量過少，可酌情減少Trizol用量；組織或細胞用量過多，會引起DNA對RNA的污染； 
高蛋白、脂肪或多糖類組織，肌肉組織或塊狀植物組織等，組織勻漿或液氮研磨后須4℃ 12,000g離心10min去掉不溶物，再進行下面操作，若頂層有脂肪物，則也須去掉；  
熱天提RNA，帶手套是必須的，手是RNase的主要來源；  
組織塊用液氮研磨，效果，若沒有液氮或電動勻漿器，可用手動勻漿器代替，此時組織塊不宜過大，且需先用眼科剪刀將組織堿堿剪碎，然后再充分研磨。   

6.1.2.1 肝臟、腸道、肌肉總RNA提取方法 
①使用已高溫蒸汽滅菌的手術刀和鑷子從魚的腹部解剖開，從中取出完整的肝臟、腸、肌肉等組織，置于離心管后立即放入液氮中； 
②組織在液氮下研磨成粉，取少量至加有1mLTrizol的1.5ml離心管中，充分混合后于4℃，12,000rpm離心15min； 
③取上清移至新1.5ml離心管中，加入200ul氯fang，劇烈震蕩直至呈乳白色，于4℃，12,000rpm離心15min； 
④取上清移至新1.5ml離心管中，加入500ul異丙醇，輕輕顛倒10次，冰上放置20mins，于4℃，12,000rpm離心15min； 
⑤棄上清，加入1ml75%乙醇（用DEPC水現配現用），于4℃，12000rpm離心5min，重復此步驟一次； 
⑥棄上清后，室溫干燥5-7mins； 
⑦加入適量（20-30ul）的DEPC水溶解沉淀65℃溶解，-20℃（-80℃）保存，檢測RNA濃度，并電泳檢測。

6.1.2.2 RNA濃度測定和電泳檢測 
取2ul提取好的RNA溶液，于Nanodrop 2000 Spectrophptpmeter測定RNA濃度及A260/A280的相對吸光度，純凈RNA的A260/A280應在1.8-2.2之間。 
電泳檢測：1%瓊脂糖，1×ATE緩沖液，90V電泳30min，凝膠成像系統觀察，分析結果。  

6.1.2.3 肝臟、肌肉、腸道樣品cDNA的合成 
    反應按照TaKaRa公司的PrimeScript® RT reagent Kit With gDNA Eraser（Perfect Real Time) 反轉錄試劑盒說明書進行，合成cDNA模板。

①基因組DNA的除去反應，在PCR管中配置如下緩沖液。    
        試劑                            用量

5×gDNA Eraser Buffer                   2.0 μl

gDNA Eraser                             1.0 μl

Total RNA                               X* ul

RNase Free dH2O                         up to 10 μl 
   X*：根據檢測到的RNA濃度來配置； 混合均勻后，室溫放置20-30min 

②反轉錄反應，在PCR管中配置如下緩沖液（20ul system），反應液配制在冰上進行。為了保證反應液配制的準確性，進行各項反應時，先按反應數+1的量配制Master Mix ，然后再分裝到每個反應管中。  
           試劑                                     使用量

5×PrimeScript® Buffer 2（for Real Time）           4.0 ul 
PrimeScript® RT Enzyme Mix I                        1.0 μl

RT Primer Mix                                       1.0 μl

①的反應液                                           10.0 ul

RNase Free dH2O                                     up to 20 μl  

③混合均勻后，在PCR儀上進行逆轉錄反應，反應條件為： 

37℃    15 min 85℃     5 sec 
然后將得到的cDNA存放于-20℃冰箱保存待用。