WesternBlot原理
WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。SDS-PAGE可對蛋白質樣品進行分離，轉移到固相載體——例如硝酸纖維素薄膜（NC）上。固相載體可以吸附蛋白質，并保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。轉移后的NC膜就稱為一個印跡（blot），用蛋白溶液（如5%BSA或脫脂奶粉溶液）處理，封閉NC膜上的疏水結合位點。用目標蛋白的抗體（一抗）處理NC膜——只有待研究的蛋白質才能與一抗特異結合形成抗原抗體復合物，這樣清洗除去未結合的一抗后，只有在目標蛋白的位置上結合著一抗。用一抗處理過的NC膜再用標記的二抗處理，二抗是指一抗的抗體，如一抗是從鼠中獲得的，則二抗就是抗鼠IgG的抗體。處理后，帶有標記的二抗與一抗結合形成抗體復合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白質的位置。

(一)配膠

1.將玻璃板洗凈，zui后用ddH2O沖洗，將與膠接觸的一面向下傾斜置于干凈的紙巾晾干。

2.分離膠及濃縮膠均可事先配好（除AP及TEMED外），過濾后作為儲存液避光存放于4℃，可至少存放1個月，臨用前取出室溫平衡（否則凝膠過程產生的熱量會使低溫時溶解于儲存液中的氣體析出而導致氣泡），加入10%AP及TEMED即可。

3.封膠：灌入2/3的分離膠后應立即封膠，膠濃度＜10%時可用0.1%的SDS封，濃度＞10%時用異丁醇或異戊醇，也可以用0.1%的SDS。封膠后靜置至膠凝固。待膠凝后將封膠液倒掉，如用醇封膠需用大量清水及ddH2O沖洗干凈，然后加少量0.1%的SDS，目的是通過降低張力清除殘留水滴。

4.灌好濃縮膠后1h拔除梳子，注意在拔除梳子時防止氣泡進入梳孔使梳孔變形。撥出梳子后用ddH2O沖洗膠孔兩遍以去除殘膠，隨后用0.1%的SDS封膠。若上樣孔有變形，可用適當粗細的針頭撥正。30min后上樣，長時間有利于膠結構的形成，因為肉眼觀的膠凝時其內部分子的排列尚未完成。(10%的AP現配現用，如在4℃存放勿超過兩周。30%的丙烯酰胺如有沉淀，棄掉)

(二)樣品處理

1.培養的細胞（定性）：

1)去培養液后用溫的PBS沖洗2~3遍（冷的PBS有可能使細胞脫落）。

2)對于6孔板來說每孔加200~300uL，60~80℃的1×loadingbuffer。

3)用細胞刮刮下細胞后在EP管中煮沸10min，期間vortex2~3次。

4)用干凈的針尖挑絲，將團塊棄掉，如果沒有團塊但有拉絲現象，則可以將EP管置于0℃后在14000~16000g離心2min，再次挑絲。若無團塊也無絲狀物但溶液有些粘稠，可通過使用1ml注射器反復抽吸來降低溶液粘滯度，便于上樣。

5)待樣品恢復到室溫后上樣。

2.培養的細胞（定量）：

1)去培養液后用溫的PBS沖洗2~3遍（冷的PBS有可能使細胞脫落）。

2)加入適量的冰預冷的裂解液后置于冰上10~20min。

3)用細胞刮刮下細胞，收集在EP管后超聲（100~200w）3s，2次。

4)12000g離心，4℃，2min。

5)取少量上清進行定量。

6)將所有蛋白樣品調至等濃度，充分混合沉淀后加loadingbuffer后直接上樣，剩余溶液（溶于1×loadingbuffer）可以低溫儲存，-70℃一個月，-20℃一周，4℃1~2天，每次上樣前98℃，3min。

3.組織：

1)心肝脾腎等組織可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液。可手動或電動勻漿。注意盡量保持低溫，快速勻漿。

2)12000g離心，4℃，2min。

3)取少量上清進行定量。

4)將所有蛋白樣品調至等濃度，充分混合沉淀加loadingbuffer后直接上樣，剩余溶液（溶于1×loadingbuffer）可以低溫儲存，每次上樣前98℃，3min。

(三)電泳

1)所有蛋白樣品調至等濃度后上樣，樣品兩側的泳道用等體積的1×loadingbuffer上樣，Marker也用1×loadingbuffer調整至與樣品等體積。
2)以初始電壓為45V時的電流強度進行穩流電泳，當電壓達65V時改為穩壓電泳。

3)在目的蛋白泳動至距膠下緣1cm以上結束。

（四）轉膜

1.電泳結束前20分鐘左右戴上手套開始準備：

濕轉使用常規電轉液：Tris3.0g，Gly14.4g，M-OH200ml，加去離子水至1000ml。干轉則取此轉移液，每50ml加入180ul10%SDS。
浸泡NC膜：將NC膜平鋪于去離子水面，待其自然吸水后再*浸入水中10min以排除氣泡，隨后浸泡入轉移液中。PVDF膜則在M-OH中浸泡20min以上后轉入轉移液中。將濾紙也浸入轉移液中。

2.取膠：
將膠卸下，保留30-100KD或分子量范圍更廣些的膠，左上切角，在轉移液中浸泡一下，置于潔凈玻璃板上，按順序鋪上膜與膜每側的一張（干轉每側三張）濾紙。用玻棒逐出氣泡后剪去濾紙與膜的過多部分（尤其是干轉，以防止短路）。

3.轉膜：
濕轉：電轉槽用去離子水淋洗晾干，加入1000ml電轉液。將膠平鋪于海綿上，滴加少許電轉液再次驅趕氣泡，封緊后放入電轉槽，注意膜在正極一側。降溫，將電泳槽置于冰水混合物中。恒流100mA過夜，或400mA，4h。注意不同蛋白的要求不同。
干轉：電轉液淋洗石墨電極，濾紙吸干，鋪上膠，再滴少許電轉液，以1.5mA/cm2凝膠面積轉移1-2小時。負載電壓不宜超過1V/cm2膠面積。
電轉液配方：Tris-base3g,glycine14.4g,200ml甲醇/1L

(五)封閉及雜交

1)封閉：將膜從電轉槽中取出，去離子水與PBST或TTBS稍加漂洗，放于封閉液中緩慢搖蕩一小時。

2)結合一抗：將含有一抗的封閉液滴加在搖床的塑料膜上，從封閉液中取出Western膜，濾紙貼角稍吸干，正面朝下貼在一抗上，注意不要產生氣泡，室溫下輕搖孵育一小時或4℃靜置過夜。在反應體系外面罩一濕潤平皿以防止液體過多蒸發。

3)洗滌：一抗孵育結束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。

4)結合二抗：選擇合適的二抗，根據鑒定方法選擇HRP或AP標記的抗體，按相應比例稀釋（1:1000~1:10000），室溫輕搖一小時。

5)洗滌：二抗孵育結束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。

(六)發光鑒定

1.HRP-ECL發光法：

將A、B發光液按比例稀釋混合。膜用去離子水稍加漂洗，濾紙貼角吸干，反貼法覆于A、B混合液滴上，熄燈至可見淡綠色熒光條帶（5min左右）后濾紙貼角吸干，置于保鮮膜內固定于片盒中，迅速蓋上膠片，關閉膠盒，根據所見熒光強度曝光。取出膠片立即*浸入顯影液中1-2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片*定影，清水沖凈晾干，標定Marker，進行分析與掃描。

2.AP-NBT/BICP顯色法：

每片NBT/BICP可溶解于30ml水中，使用前將一片分裝在30個EP管中，每張3×9cm的膜取一管配成1ml即可。將PBST或TTBS洗滌過的膜用去離子水稍加漂洗，濾紙貼角吸干，反貼法覆于NBT/BICP溶液液滴上，并用不透明物體（如報紙）遮擋光線，顯色20s后每10s觀察一次，至條帶明顯或有本底出現時將膜揭起置去離子水中漂洗后放濾紙上晾干即可觀察與掃描。背景深淺與一抗的質量及二抗的量有關，當然如果暴光時間長達半小時，出現背景是正常的。