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上海嘉鵬
主營產品： 超微量分光光度計,核酸蛋白檢測儀,超微量紫外分光光度計,nano光度計,超微量核酸蛋白檢測儀 |
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2022-3-9 閱讀(2994)
那么下面上海嘉鵬科技有限公司為大家簡單介紹一下關于蛋白質純化方法經典攻略（二）：
初始樣品制備
無論目標蛋白的來源如何，作為純化的初始步驟，原始樣品的制備很重要。同時也需要考慮表達和純化策略。
目標蛋白的胞外分泌可使用簡單快速親和純化方案；所需的唯*yi樣品制備可能需要傾倒貼壁細胞的條件培養基或者低速離心以去除懸浮細胞。當然，制備過程的**步色譜層析時可能需要加入蛋白酶抑制劑或者調節pH，但這些步驟簡單易行。然而，如果**步純化樣品步驟進行離子交換，樣品則可能需要首先脫鹽。當處理大量條件培養基時可能會有技術難度；根據培養基的脫鹽體積常可采用透析或錯流過濾。
如果靶蛋白在胞內表達，則細胞首先需要通過離心獲取，然后用合適的裂解緩沖液重懸。如上所述，裂解緩沖液需要包含合適的緩沖液和其它添加劑以確保靶蛋白的*大穩定性。如果研究者在柱層析之前避免耗時的緩沖液交換步驟，則樣品/裂解緩沖液的組成也需與隨后的純化步驟相適宜。
接下來，需要有效的細胞裂解方法。大腸桿菌可以通過弗氏壓碎器裂解（盡管這種方法不容易規模化），超聲或基于洗滌劑的裂解（有很多商業裂解試劑）。通過向裂解緩沖液中加入溶菌酶可以改善基于洗滌劑的裂解效率。基于洗滌劑的裂解非常溫和，且不導致細*菌DNA的顯著切變。因此，為了降低樣品粘度產生具有良好流動特性的樣品，通常需要加入含DNA酶（高純度制劑可商購）。
哺乳動物和昆蟲細胞也可以通過超聲或基于洗滌劑的方法裂解。如果核膜顯著裂解，可能需要DNA酶處理降低樣品粘度。
一旦細胞（微生物/昆蟲/哺乳動物）被裂解，通常需要離心除去細胞碎片（通常在4℃下15000×g離心15分鐘，以避免色譜柱堵塞）。所得上清液即可開始用于靶蛋白的柱色譜層析純化。
柱層析設備柱層析的基本原理是將一份蛋白質混合物分成很多小份，從而使某些組分中目標蛋白的濃度通過濃縮得以增大。雖然已經有很多昂貴和特殊的設備可用于柱層析，但實際上它只需要*基本的設備即可。
基本柱層析設備1、固定相：一種惰性介質, 通常帶有一種可促進蛋白質相互作用的官能團以進行蛋白質分離。固定相和官能團的選擇取決于層析色譜和方法的種類。
2、柱子：一種圓柱形玻璃容器，長度和直徑各不相同。柱子可以直接購買已填裝固定相能直接連接到層析設備上使用的預裝柱，或可購買空柱自己手動填裝。自動層析設備和人工重力柱使用的是不種類型的柱子。
3、溶劑：含有添加劑的緩沖液，作為將蛋白質在固定相上平衡和洗脫的流動相。不同類型的柱層析需要不同的溶液條件。
4、收集管：用于收集洗脫液樣品的容器。自動組分收集器需要特定的收集管。手動收集時，則試管或容器均可使用。
5、純度檢測方法：一種檢測樣品里所有蛋白質中目標蛋白相對含量的檢測手段。每一步獲得的含有目標蛋白的組分都必須在進行下一步純化工作前進行檢測。后面的章節將對一些常用的純度分析方法進行討論。
層析系統柱層析可以依賴用泵將溶劑以固定流速打入填裝好的層析柱的自動設備來完成或者依靠流動相的重力作用自己完成。自動系統或者重力柱系統均可與自動組分收集器連接使用。
| 系統類型 | 優點 | 缺點 |
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親和層析的固定相是一種共價結合特異性配體的惰性介質，該配體可與一個蛋白質或一類蛋白質特異性結合。惰性介質通常是交聯的瓊脂糖或者聚丙烯酰胺。蛋白質可采用選擇性或非選擇性模式來進行親和柱層析純化。在選擇性親和柱層析中，一般使用對蛋白質有特異性作用的配體或共價結合的標簽。在非選擇性親和柱層析中，如用于免*疫球蛋白純化的蛋白A、G、L，用于DNA結合蛋白的肝素或用于糖蛋白的凝集素等，這些配體與一類蛋白都具有相似的結合能力。
圖 4. 用蛋白A、G、L進行親和層析的原理示意圖：A.抗體含有多個功能區：一類蛋白質的Fc區（片段，恒定區） 都是相同的，Fv區（片段，可變區）是每個抗體各不相同的特異區，Fab（片段，抗原區）是抗體實際與特異性抗原結合的區域。B.抗體的特異性區域可以通過親和色譜進行非選擇性純化，在該過程中，配體 （蛋白 A、G、L）是結合在分離介質上的。C. 蛋白A、G、L亦可用于純化特異性蛋白。這種情況下，抗體作為中間配體為其抗原提供選擇性。
兩類親和色譜中，在不影響蛋白質（或標簽） 和配體間作用力的條件下，蛋白質均在柱上保留。在不破壞特異性相互作用但可破壞所有雜蛋白與固定相間其非特異性作用的條件下，對所有結合的蛋白質進行淋洗。*后用含有競爭分子的緩沖液或者可破壞所有蛋白質間相互作用的條件對結合蛋白進行洗脫。
競爭分子可代替目標蛋白與配體相結合。這種競爭分子可通過其他層析手段或者透析的方式從目標蛋白中去除。通過破壞所有蛋白間相互作用來從固定相洗脫蛋白的方法包括調節緩沖液的pH值或者離子強度。因為這些方法同樣會影響蛋白質的穩定性，因此通常建議洗脫下來的蛋白質要立即中和或者稀釋以將危害降到*小。有報道稱，對于不同形式的親和層析，為獲得*高產率的活性蛋白需采用多種不同的流動相條件 。
| 目標蛋白 | 配體伴隨 | 洗脫 |
| 問題 | 原因 | 解決方法 |
以上就是上海嘉鵬科技有限公司為大家整理總結蛋白質純化方法經典攻略（二）。
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