摘要：本應用簡報重點介紹了使用雙通道血醇分析儀，采用 Agilent J&W DB-ALC1 和 DB-ALC2色譜柱，通過靜態頂空 GC/FID 分析血醇濃度。雙柱/雙FID 的配置組合在測定復雜血液基質中的酒精時能夠提供良好的精度和重現性。

前言頂空氣相色譜最常見和普遍的一個應用是測定醉酒駕駛人員血液中的乙醇含量 [1]。判斷是否酒駕的通用閾值是 0.08 g/dL，測定方法必須穩定和經過優化，以確保報告值的準確性。雖然酒精檢測是法醫實驗室的常規分析項目，但也可能發生細微的誤差，從而改變最終的報告值。定量分析時使用內標法有助于抵消基質差異 [1]。實驗中通常選擇與乙醇性質相似的其他醇類（如，正丙醇和叔丁醇）作為內標物。這些內標物與乙醇的化學極性相似，在血液中的基質效應也相同，所以選擇這些內標物能夠補償基質效應。與外標法相比，使用內標法校正的百分比誤差更小在方法檢測限和閾值兩個濃度下均重復測定樣品，通過計算得到相對標準偏差，確定方法的精度。使用正丙醇和叔丁醇做為內標，頂空法最高可測定 0.30 g/dL 的血醇樣品。

材料與方法使用帶分流/不分流進樣口的 Agilent 7890B GC/FID、帶頂空控制軟件 ChemStation（B.01.04 版）的 Agilent 7697A 頂空進樣器和用于氣相色譜系統的 Agilent OpenLab CDS ChemStation 軟件（C.01.05 版）進行 GC/FID 實驗。氣相色譜條件色譜柱： Agilent J&W DB-ALC1，30 m × 0.32 mm，1.8 µm（部件號 123-9134），DB-ALC2，30 m × 0.32 mm，1.2 µm（部件號 123-9234）載氣： 氦氣柱溫： 40 °C (4.00 min)進樣口： 分流模式，250 °C，分流比 20:1進樣口襯管： 超高惰性直型襯管，75 mm（部件號 5190-4048）GC/FID: Agilent 7890B GC，配置雙 FID進樣器： Agilent 7697A 頂空進樣器，帶 12 位樣品盤流路備件樣品瓶： 平底螺口蓋頂空樣品瓶，20 mL（部件號 5188-2753）樣品瓶蓋： 螺紋口瓶蓋和隔墊，PTFE/硅橡膠，18 mm（部件號 5188-2759，100/包）傳輸線： 去活管線，內徑 0.53 mm（部件號 160-2535-5）三通接頭： 微板流路控制技術，兩通未吹掃分流器（部件號 G3181B）隔墊： 流失性和溫度經過優化 (BTO) 的 11 mm 隔墊（部件號 5183-4757，50/包）分流平板： 超高惰性分流平板（部件號 5190-6145，10/包）CFT 密封圈： 可塑金屬密封圈（部件號 G3188-27502，用于內徑0.32 mm 色譜柱，10/包；部件號 G3188-26503，用于內徑 0.53 mm 管線，10/包），內螺母（部件號 GB2855-20530）進樣口/FID： 85:15 Vespel：石墨密封圈（部件號 5062-3514，10/包）

實驗設置的基本布局見圖 1。

樣品前處理乙醇參比標樣購自 Restek，Bellefonte（美國賓夕法尼亞州）。標樣的前處理步驟同樣品，即將 500 µL 各參比標樣溶液加入 4.5 mL蒸餾水和 5 µL 經稀釋的內標物中。將正丙醇或叔丁醇 (J. T. Baker) 用蒸餾水稀釋 10 倍，制為內標儲備溶液，則最終工作理論濃度為 0.08 g/dL。向 20 mL 呃已知的消毒羊血中分別加入 5 µL 和 20 µL 乙醇（200 proof 無水乙醇，KOPTEC USP），制得 0.02 g/dL 和 0.08 g/dL 乙醇濃度已知的儲備血液樣品。

結果與討論圖 2 和圖 3 所示為 8 種化合物標樣混合物通過 DB-ALC1 (FID1) 和DB-ALC2 (FID2) 獲得的分離色譜圖。在定性鑒定時，每種標樣的保留時間都能準確匹配其相應單獨標樣的保留時間。盡管混合物在單柱上存在多個共流出現象，但是我們能夠借助它們在 DB-ALC1和 DB-ALC2 上的保留時間辨別它們的流出順序，進而進行后續的峰鑒定。該雙柱方法的一個優點在于乙醇和其他常見代謝物在兩個不同固定相上的流出順序不同。雙柱/雙 FID 方法為我們提供了額外的確認信息，減少了干擾或其他醇類與乙醇共流出的可能。

表 1 總結了分別使用叔丁醇和正丙醇做為內標時，乙醇標稱濃度分別為 0.02% 和 0.08% 的樣品重復測定 10 次的結果。總體而言，叔丁醇做為內標時的結果變異性大于正丙醇。使用叔丁醇作為內標時，0.02% 和 0.08% 乙醇樣品重復測定的 % RSD 值最高可達17.08%，使用正丙醇作為內標時，% RSD 值最高僅為 4.53%。以正丙醇做為內標，0.02% 和 0.08% 乙醇濃度下的 % RSD 值較一致，均低于 5%，證明該方法精度十分優異。圖 4 和圖 5 所示為兩種內標法的校準曲線。很明顯，以正丙醇做內標獲得的結果更好，因為其測定值與理論值更接近。與叔丁醇內標相比，以正丙醇做內標時相對響應系數和回歸線的斜率均更高，進一步說明使用正丙醇做為內標的效果更好。叔丁醇是一種熔點較低（熔點 25 ~ 26 °C）的固態物質，如果實驗室溫度控制不夠理想，尤其是在冬季，則可能會帶來一些麻煩。而異丙醇的熔點為 -89 °C，即使溫度低于水的凝固點，它也仍會以液態形式存在。

結論Agilent J&W DB-ALC1，30 m × 0.32 mm，1.8 µm 和 DB-ALC2，30 m × 0.32 mm，1.2 µm 氣相色譜柱在測定復雜血液基質中的血醇濃度時表現出了精度和重現性。分別使用正丙醇和叔丁醇做為內標時，結果存在顯著差異。總體而言，重復樣品檢測中使用正丙醇作為內標所得的結果精度更高。以正丙醇作為內標時，0.02 g/dL 和 0.08 g/dL 濃度的重復樣品在兩根色譜柱上所得結果的相對標準偏差均小于等于 5%。在 DB-ALC1 和 DB-ALC2 上使用正丙醇做為內標，進行連續校準驗證時，兩根色譜柱上的誤差均小于 6%。而使用叔丁醇做為內標時，連續校準驗證的誤差約為 10%。很明顯，在使用靜態頂空 GC/FID雙柱（DB-ALC1和 DB-ALC2）、雙 FID 配置分析血醇濃度時，正丙醇是理想的內標選擇。使用全自動安捷倫氣相色譜頂空系統進行高通量血醇分析時，采用雙柱配置、帶 CFT 分流器的分流進樣、可塑金屬密封圈以及Agilent J&W DB-ALC1 和 DB-ALC2 色譜柱，分析周期僅為 3 分鐘，而且還能分離乙醇、內標以及四種潛在的干擾物質。