引言維生素是維持機體健康生長且必須從食物中獲取的微量營養物質。維生素一般被分為兩類，水溶性維生素和脂溶性維生素。由于食品中存在從納克到微克級不同含量水平的維生素，因而像嬰幼兒配方奶粉中的維生素，需要標示其含量是美國食品藥品監督管理局（FDA）的一項強制性規定。各維生素化學性質的差異使得所有維生素的共同提取和分析挑戰。基于此，水溶性和脂溶性維生素的分析通常分別進行。之前的一篇安捷倫應用解決方案1提供了同時分析 10 種水溶性維生素的方法。本研究探討了同時分析 9 種脂溶性維生素的方法，這些都是食品中常見的脂溶性維生素。盡管各種脂溶性維生素的提取步驟不盡相同，但文中建立的分析方法可通過一次 LC 運行對分析物定量，從而降低了分析難度。本文采用 UV 檢 測，建 立了 耗 時 大 約15 min、靈敏度高、耐用性好的方法，可同時分析 9 種脂溶性維生素，并可將該 HPLC 法轉換為耗時僅 3.5 min 的UHPLC 法，滿足了特別需要短分析時間的用戶。

實驗部分儀器和軟件采用包含以下模塊的 Agilent 1260 Infi nity四元泵 LC 系統：• 集成真空脫氣機的 Agilent 1260 Infi nity四元泵（G1311B）• Agilent 1260 Infi nity 高效自動進樣器（G1367E）• Agilent 1260 Infi nity 柱溫箱（G1316C）• 配備 60 mm 光程流通池的 Agilent 1260Infi nity 二極管陣列檢測器（G4212B）采用包含以下模塊的 Agilent 1290 Infi nityLC 系統建立并實現 UHPLC 分析：• 集成真空脫氣機的 Agilent 1290 Infi nity二元泵（G4220 A）及 100 µL Jet Weaver混合器• Agilent 1290 Infi nity 高效自動進樣器（G4226A）• Agilent 1290 Infi nity 柱溫箱（G1316C）• 配備 10 mm 光程流通池的 Agilent 1290Infi nity 二極管陣列檢測器（G4212A）

色譜柱：• Agilent Poroshell 120 EC-C18 色譜柱，內徑 2.1 mm，柱長 75 mm，填料粒徑 2.7 µm（697775-902）• Agilent Poroshell 120 EC-C18 色譜柱，內徑 3.0 mm，柱長 150 mm，填料粒徑 2.7 µm（693975-302）軟件：• 安捷倫化學工作站（B.04.02 版）試劑和材料所有化學藥品和溶劑均為色譜級。高純水由 Milli Q 水純化系統（Millipore Elix10，Millipore，USA）制備。超梯度級的乙腈和甲醇購自 Lab-Scan 公司（泰國曼谷），Biotech 級的四氫呋喃（THF）購自 Sigma 公司（德國）。洗脫液添加劑醋酸購自 Fluka 公司（德國），本研究所用的其它化學品均為 Aldrich 公司（印度）產品。標準品：甲萘醌（K3）、亞麻酸（6-ω 脂肪酸）、視黃醇、視黃酸、膽骨化醇（D3）、生育酚用于本研究中回收率測定和營養標示分析的嬰幼兒配方奶粉和復合維生素片均購自當地。

往 5 g 嬰幼兒配方奶粉或單片復合維生素片中加入 25 ng 標準品，通過加標和不加標樣品分析進行回收率研究。該方法可有效轉移至 UHPLC。本文中評價了各種維生素的 LOD、LOQ 和線性關系，并通過峰面積和保留時間的 RSD 評價方法的精密度，同時繪制了所有維生素的線性曲線。

結果與討論分離與檢測采用 Agilent Poroshell 120 EC-C18（3.0 mm x 150 mm，2.7 µm）色譜柱使9 種脂溶性維生素 13 min 內得到分離。基于分子結構的差異，不同維生素的最大吸收波長不同。9 種維生素的色譜洗脫模式見圖 1，各維生素及其最大吸收波長如表 2 所示。216 nm 所檢測色譜圖中的基線漂移是因為在梯度運行中流動相改性劑的比例發生了變化。采用化學工作站軟件中的峰純度檢測功能考察每個色譜峰的純度，然后評價方法的專屬性。本文中方法學驗證內容包括了精密度、線性范圍、準確度、專屬性、回收率和耐用性實驗

 

保留時間（RT）和峰面積的精密度計算進樣量為 50 ng 的 9 種維生素的保留時間（RT）和峰面積的相對標準偏差（RSD）以評價方法的精密度。測得峰面積的 RSD 最大值為 0.035%，保留時間的RSD 最大值為 0.04%。9 種維生素的峰面積和保留時間的 RSD 值如圖 4 所示。

耐用性通過刻意改變六個關鍵的方法參數評價該方法的耐用性，同時計算所產生的峰面積和保留時間的偏差，并與原方法結果進行比較。例如，維生素的加標混合樣品平行測定 6 次，保留時間和峰面積的允許偏差分別為 ± 3% 和 ± 5%。耐用性研究結果匯總見表 4。耐用性研究考察了增大流速、改變流動相組成及柱溫，結果表明保留時間的偏差均在允許的限度內。但是，洗脫梯度斜率變化的影響較大，測得的保留時間偏差超過了限度。除了8 種維生素峰面積的偏差在大多數實驗中均在允許的限度內。峰面積受流速、梯度斜率、柱溫、流動相組成和檢測波長的影響很大。并且檢測波長需嚴格控制。耐用性結果表明，該方法對于常規檢測是可靠的，在很大程度上，測定結果未受參數改變的影響。

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結論本研究使用 Agilent Poroshell 120 EC-C18色譜柱對 9 種脂溶性維生素進行分離和定量。先用 Agilent 1260 Infi nity LC 系統建立了耐用、耗時 15 min 的 HPLC 梯度洗脫方法。該方法可成功地用于定量分析維生素，如甲萘醌、亞麻酸以及不同形式。本方法的線性范圍寬，涵蓋許多食品中這些維生素可能的濃度。梯度洗脫可確保更好的色譜分離、提高靈敏度并減少基質干擾。該方法簡便、快速、專屬性強、靈敏度高，并具有良好的精密度、線性關系和回收率。通過嬰幼兒配方奶粉和復合維生素片中的定量分析證實了該方法的高效性。之后，將該方法轉換為采用 Agilent 1290Infi nity LC 系統的 UHPLC 法，其耗時僅3 min，并可節省 66% 的分析時間和溶劑。采用 Agilent 1260 Infi nity LC 系統和 Agilent 1290 Infi nity LC 系統的方法可用于脂溶性維生素準確的常規營養標示分析。