摘要有歷史記載以前，人們就已經開始用草藥提取物治療疾病。通過多少代人的臨床經驗和教訓逐漸發現了其在人體中的活性和作用。中藥（TCM）就是一個很好的例子。天然來源的西方藥物由于其潛在價值，也越來越受到重視，但是要建立西藥的質量控制標準，需要對天然產物的藥用成分進行深入了解。本應用報告報導了用 Agilent1200 系列高分離度快速液相色譜系統結合快速分離高通量（RRHT）柱分離復雜的人參提取物中各組分的方法。用離子阱 MSn 和 MRM 獲得的信息確定各組分的結構，并用于質量控制。

前言有歷史記載以前，世界各地的所有古老文明都曾經用植物和動物源性粗提物治療疾病。幾百年的臨床經驗和教訓使人類逐漸發現了其治療不同疾病的活性以及對人體的其它作用，這些寶貴的經驗世代相傳。中藥（TCM）是這一經驗不斷積累、優 化 過 程 的 最 好 例 證 。人 參 （Panaxspecies）是一種使用了 5000 多年的著名亞洲草藥。已有報導的人參藥理作用包括，對中樞神經系統（CNS）的刺激和抑制作用、抗高血壓、抗高血糖、抗癌和免疫調節等作用 5。其主要活性化合物人參皂甙屬于三萜皂甙，目前已分離和鑒定出了 80 多種。過去 30 年來，在建立分析人參提取物和制劑的分析方法方面，人們已經做了大量工作。分析人參等復雜天然產物提取物的方法，是高效液相色譜法(HPLC)[1]。現在也采用 LC/MS 儀器測定復雜的和結構相似的人參皂甙，如用LC/ESI oaTOF 進行精確質量測定，用LC/離子阱或 LC/三重串聯四極桿質譜儀，通過 MS/MS 和 MSn 進行結構解析[2]。特別是可以用離子阱 MSn 碎片輪廓譜確證藥用人參產品的可信性及其活性成分之間的差異[3]。

本應用報告將報導，用 Agilent 1200 系列高分離度快速液相色譜系統與 1.8 µm色譜柱分離復雜人參提取物中的各組分。用離子阱 MSn 和 MRM 得到的信息測定各組分結構并用于質量控制。在本系列應用報告的第 I 部分已經報導了高分離LC 系統與 ESI oaTOF 精確質量測量的應用[4]。

實驗部分儀器• 帶脫氣機的 Agilent 1200 系列 SL 型二元泵。該泵能夠用于 1.8 µm 粒徑 RRHT色譜柱的高分離度 HPLC 分析，并獲得最佳性能• 帶溫度控制的 Agilent 1200 系列 SL 高效自動進樣器。該自動進樣器是為Agilent 1200 系列 SL 型二元泵確保低延遲體積而特別設計的• Agilent 1200 系列柱溫箱 (TCC)。該TCC 將與 Agilent 1200 系列 SL 型二元泵和可選件分離式熱交換器，以及柱后冷卻一起使用，在優化的延遲體積條件下，用可選件 2 位/10 通閥進行交替色譜柱再生• Agilent 1200 系列 SL 型二極管陣列檢測器 (DAD)。該 DAD 能以高達 80 Hz 的采樣速率收集數據。萬一網絡出現問題，儀器將啟動內置的數據存儲功能• Agilent 6330 離子阱 LC/MS。該離子阱配置標準 ESI 源，能以 26000 m/z /秒的速度掃描。可以數據依賴地全自動獲取 MSn 圖譜• 儀器控制所用的軟件是化學工作站B01.03，離子阱軟件 5.3，用離子阱數據分析軟件 3.3 分析數據• 色譜柱：ZORBAX SB-C18，2.1 x 150 mm，1.8 µm樣品粉碎的凍干人參 (1g) (Panax ginseng)加入 10 mL 甲醇，超聲處理 30 分鐘，過濾后直接分析。Agilent 6330 離子阱 LC/MS 系統的設置如圖 1 所示。Agilent 1200 系列 SL 型二元泵用 0.17 mm 內徑不銹鋼毛細管與Agilent 1200 系列 SL 型高效自動進樣器(ALS SL)相連。為減少延遲體積，ALS SL的針座毛細管內徑為 0.12 mm。同樣類型的毛細管連接 Agilent 1200 系列柱溫箱中的低延遲體積(1.6 µL)熱交換器，柱溫箱連接色譜柱。Agilent 1200 系列 SL 型二極管陣列檢測器中內置 2 µL 流通池進行UV 檢測。出口毛細管直接連接到 6330離子阱 LC/MS 電噴霧源的霧化器上，該儀器能以 26000 m/z/秒的速度進行掃描。優化儀器設置以獲得最大分離度，對人參（Panax ginseng）復雜天然產物提取物進行的 UV 分析證明了這一點。為了驗證其性能，對 Agilent 1100 系列 LC 系統（5µm 粒徑柱）和 Agilent 1200 系列高分離度快速液相色譜系統（1.8 µm 粒徑柱）的分析進行了比較[4]。在 220 nm 波長下獲得的 UV 色譜圖清楚地表明，Agilent1200 系列高分離度快速液相色譜系統的色譜峰分離度更高。UV 色譜圖中大多數基線分離峰的峰寬 (FWHM) 小于 0.1 分鐘。高分辨配置的 Agilent 1200 系列高分離度快速液相色譜系統的全部性能在另一篇應用報告中報導[5]。該系統稍加改動也可以用于高通量分析，這在另一篇應用報告中有詳細報導[6]。

方法• Agilent 1200 系列 SL 型二元泵的操作條件如下：溶劑 A： 水 + 0.1% TFA溶劑 B： 乙腈 + 0.1% TFA流速： 0.5 mL/min梯度： 0 分鐘 5% B,1 分鐘 5 % B,60 分鐘 85 % B,61 分鐘 95 % B,70 分鐘 95 % B

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停止時間： 70 分鐘后運行時間：15 分鐘• 用 Agilent 1200 系列 SL 型高效自動進樣 器 進 樣 10 µL 樣 品 ，樣 品 冷 卻 至10 oC。1 分鐘后樣品定量管切換到旁路，以縮小延遲體積• Agilent 1200 系列 SL 型柱溫箱調節到50 oC，配置低延遲體積熱交換器• 用 Agilent 1200 系列 SL 型二極管陣列檢測器以 80 Hz 在 220 nm/4 nm 波長（參比 360/100）下采集數據，配置 2µL 流通池，30 mm 光程• 6330 離子阱 LC/MS 在下列條件下操作：離子源： ESI 正離子模式干燥氣： 5.0 L/min干燥溫度： 300 oC霧化器： 15 psi靶標： 125000最長累加時間： 100 ms掃描： 200-1300平均： 2MSn： 自動化 MS/MS 和 MS3

結果與討論在高分離度 HPLC 上用 1.8 µm 粒徑色譜柱對人參粗提物中各組分進行分離后，再使其碎裂進行 MSn 分析。主要成分在 20到 33 分鐘之間洗脫，在基峰色譜圖中標為人參皂甙 Re、Rf、F11、Rb1、Rb2、Rc、Rd（圖 2）。所用色譜柱的高分離度使人參提取物中大量微量化合物得到了分離，由于掃描速度高達 26000 m/z/秒，足夠采集離子阱 MS/MS 和 MSn 數據，因此這些小峰也可以被分析。本應用深入研究了 人 參 皂 甙 Re、Rb1 和 Rc 的 離 子 阱MS/MS 和 MS3 數據，用于結構解析，而品種依賴的 Rf 和 F11 人參皂甙分析在另一部分中討論[7]。圖 1Agilent 1200 系列高分離度快速液相色譜系統與 MS 聯用，采用低延遲體積配置95 5989-4705EN簡單 MS 掃描得到質子化和加合形式的分子離子質量（圖 3）。質子化和加合離子的比值取決于電噴霧離子源的溫度，因為加合復合物在高溫下比質子化離子更穩定，后者將發生裂解，丟失一個水和其它碎片。人參皂甙 Re 質譜掃描產生的離子有 m/z 928.9 [M+H-H2O]+、946.9[M+H]+、969.1 [M+Na]+；人參皂甙 Rb1產 生 的 離 子 是 m/z 1090.1 [M+HH2O]+、1108.5 [M+H]+、1131.1 [M+Na]+；人參皂甙 Rc 則得到離子 m/z 1059.71[M+H-H2O]+、1077.75 [M+H]+、1101.1[M+Na]+。 選 擇 6330 離 子 阱 質 譜LC/MS，MS/MS 和 MS3 條件產生加合離子。與質子化離子相比，這些離子的裂解能得到更清晰、更多的結構信息，其碎片與本研究第 I 部分討論的 CID 碎片相似[4]。