蛋白質磷酸化是一種非常重要的翻譯后修飾，其在細胞周 期、細胞增殖分化、代謝和凋亡等各個生物學過程中都起 到了重要的調控作用。在真核生物中，約有 1/3 的蛋白質 處于其磷酸化狀態，不同的蛋白質其磷酸化水平差異很大， 從低于 1% 到高達 90% 不等[1]。

磷酸化蛋白質組學面臨著諸多技術挑戰，如：磷酸化蛋白 質豐度較低且動態范圍大，磷酸化肽段的離子化效率相 對偏低，磷酸修飾基團的具體位置難以確定，等等。在 目前的磷酸化蛋白質組學研究中，通常都需要在質譜分 析前對樣品中的磷酸化肽段進行富集，以消除非修飾肽 段對于磷酸化肽段的鑒定抑制[2]。磷酸化肽段的富集方法 主要包括固定化金屬親和色譜（Immobilized Metal Affinity Chromatography，IMAC）[3]，二氧化鈦（Titanium dioxide, TiO2）[4] 以及基于抗體的富集方法[5]。其中二氧化鈦方法有 著富集效率高，簡單易操作的優勢，從而成為了目前廣 泛使用的富集方法。為了進一步增加磷酸化位點的鑒定深 度，通常需要對磷酸化肽段進行預分級，包括采用離子 交換色譜[6]，高 pH 反相色譜[7]，親水相互作用色譜[8]，以 及 TiO2 多次富集[9] 等方法。在這部分工作中，我們采用 TiO2 富集結合多種肽段預分級的策略，通過 Orbitrap 采 集 HCD 產生的二級碎片離子，并終使用 MaxQuant 的 PTM score 系統進行磷酸化位點的確認，從而得到了高達 40,000 個位點的 Hela 細胞磷酸化蛋白質組深度覆蓋。 

Hela 細胞用 SDT 裂解液裂解，并用 FASP 方法酶解[10]。 TiO2 富集磷酸化肽段的方法參考文獻[9]。肽段高 pH 反相 色譜預分級的方法參考文獻[7]。磷酸化肽段 SCX 分級的 方法參考文獻[11]。

色譜條件：液相色譜儀：Easy nLC 1200（ThermoFisher Scientific）