蛋白質免疫印跡實驗中條帶過多怎么辦？

標簽：免疫印跡 蛋白質 科普 抗體  蛋白質免疫印跡
    蛋白質免疫印跡是檢測復雜混合物中蛋白質抗原的常用技術。通過 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離樣品，然后將分離的蛋白質轉移到膜上。這些膜與特定于目標蛋白質的抗體一起孵育，該抗體與固定在膜上的蛋白質條帶結合。然后使用檢測系統對抗體進行可視化，該系統通常基于與 Ig 鏈結合的二級蛋白質，該蛋白質與顯色反應相關。
與理論預測相反，檢測到幾個波段的情況并不少見。雖然抗體可能并不*針對蛋白質，但其他因素可能是原因：

1. 抗原的蛋白水解分解。
這種情況并不少見，特別是如果樣品儲存時間過長，或者在起始組織均質化后分離蛋白質或膜。所有附加條帶的表觀分子量均低于全長蛋白質。特別易感的是突觸蛋白和突觸結合蛋白。應考慮添加蛋白酶抑制劑，如 PMSF、胃蛋白酶抑制劑或亮抑酶肽。 
2. 每條泳道蛋白質過多或檢測系統過于敏感。
蛋白質免疫印跡法中，凝膠過載是“鬼帶"的常見原因之一。固定的蛋白質可以提供一個集中的吸附表面，某些 IgG 可以非特異性地結合到該表面。類似地，當使用高度靈敏的檢測系統（例如增強的化學發光）時，可能會發現這種非特異性結合。起始材料的一系列稀釋通常會澄清哪些信號是人為的。
3.低效阻塞。
實驗中會應用到多種不同的封閉劑，某些非離子去污劑或蛋白質等封閉劑容易產生低效阻塞的影響。如果改變阻塞條件就可以解決此問題。
4. 抗原濃度過低。
SDS-PAGE 的分辨率一般限制在 50-100 個波段。如果抗原的相對濃度過低（小于總蛋白的 0.2%），則可能難以檢測（例如，突觸釋放蛋白/VAMP 與細胞勻漿中的組蛋白共遷移，干擾其檢測）。信號增強可能會導致人工帶的出現。因此可以適當考慮通過分級分離或免疫沉淀富集抗原。
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