細胞傳代的步驟-貼壁細胞傳代培養步驟

    傳代培養是細胞培養常規保種方法之一，也是幾乎所有細胞生物學實驗的基礎。當細胞在培養瓶中長滿后就需要將其稀釋，分種成多瓶，細胞才能繼續生長。這一過程就叫傳代。傳代培養可獲得大量細胞供實驗所需。傳代要在嚴格的無菌條件下進行，每一步都需要認真仔細的無菌操作。懸浮型細胞直接分瓶就可以，而貼壁細胞需經消化后才能分瓶。本實驗以傳代大鼠骨髓充間質干細胞為例進行細胞傳代的步驟做一介紹。

一、傳代前準備

實驗開始前，將無菌培養瓶、15ml 離心管、移液管、槍頭等放入無菌超凈工作臺，紫外線照射 30min，以進行工作臺的消毒。

倒置顯微鏡下觀察細胞形態，確定細胞是否需要傳代及細胞需要稀釋的倍數。

二、胰蛋白酶/EDTA 消化

    從培養箱中取出待傳代的細胞，75%酒精進行瓶口消毒，吸掉培養細胞的舊培養基。PBS緩沖液洗去殘留的舊培養基,重復洗兩次。

棄去 PBS,按每 25 平方厘米 1ml 消化液比例加入消化液，消化液中 EDTA 濃度視不同細胞而定，骨髓干細胞貼壁特性強，比較難于消化，

可提高 EDTA 濃度的方法，本實驗采用0.25%胰蛋白酶加 0.1%EDTA 的消化液證明可以很好地消化，并不會損傷細胞。放入顯微鏡

下觀察，待所有細胞變圓后立即拿入超凈臺內，加入 6ml 細胞培養基終止消化。消化時間為 1-5 分鐘，具體依細胞而異。

采用無菌吸管輕輕吹打細胞表面，注意吹打全部培養表面，可以按照先左右吹打，后上下吹打的方式，取所有細胞懸液放入一干凈的 15ml 離心管內。每分鐘 800 轉，室溫離心 5min。

三、細胞傳代的步驟-制備細胞懸液及培養  

   吸棄上清液，不要吸到底部的細胞沉淀。向離心管內的細胞沉淀加入適量培養基。吹打混勻，吹打過程中盡量不要產生氣泡。

顯微鏡下觀察細胞分散情況，避免出現細胞成團情況，確定為單細胞懸液方可進行下一步操作。本實驗以 1:2 的比例進行分瓶，通常骨髓充間質干細胞一般以 1：3 傳代，傳到第 3 代時，骨髓干細胞的純度可達 95%以上。將培養瓶放入 37℃，5％CO2 的培養箱內繼續培養。

四、結果觀察

  第二天可觀察細胞貼壁生長情況，細胞培養換液時間一般為 2～3d，根據細胞生長的狀態和實驗要求來確定。待細胞鋪滿器皿底面，即可使用，也可繼續傳代擴大培養或換成維持液。

懸浮細胞可以直接將培養瓶中的液體吸掉，只留下少量，然后加入新鮮培養液即可。

   當細胞懸液中碎片或顆粒物較多，感覺到比較臟時，可以將懸液移到離心管內，1000～1500rpm離心 3 分鐘，棄上清，加入約 2ml 培養液，吹打至均勻，滴加 2-3 滴至已加入新鮮培養液的培養瓶中。然后置于二氧化碳培養箱中培養。

五、傳代細胞培養的實驗步驟及注意事項

1、嚴格無菌：

傳代培養時要注意嚴格的無菌操作，并防止細胞之間的交叉污染。

2、適度消化：

    消化的時間受消化液的種類、配制時間、加入培養瓶中的量等諸多因素的影響，酶解消化過程中要不斷觀察，消化過度會對細胞造成損害，消化不夠則難于將細胞解離下來。對于貼壁能力較弱，容易脫壁的細胞，可以不經蛋白酶原消化處理和終止消化這兩步，直接對原代培養物或經漂洗后用吸管進行吹打使細胞脫離瓶皿底壁。這種直接吹大的方法對生命力旺盛的細胞如某些腫瘤細胞較為合適。高強度機械吹打易對細胞造成傷害較大，細胞也常有較大數量的丟失，因而絕大部分貼壁生長的細胞需消化后才能吹打，一般不單獨采用高強度機械吹打。

3、把握好消化液的*佳濃度：

   消化液的消化能力是和溶液的 pH、溫度、胰酶濃度及溶液中是否含有 Ca2+, Mg2+和血清等因素有關，實驗采用 0.25%胰蛋白酶+0.1%EDTA 的消化液證明可以很好地消化骨髓干細胞。

4、吹打細胞動作要輕柔：

    吹打時用力過猛會損傷細胞。可選擇用用大口徑的吸管或者管口較大的一次性耗材，減少對細胞的損傷。對貼壁細胞消化后的吹打過程要有序進行，要從一邊開始到另一邊結束，尤其是器皿的四角處，確保瓶皿底壁各處的細胞都被吹打脫離。

5、傳代次數不宜過多：

    傳代數是指對培養物傳代的次數，它不等于細胞分裂的次數或細胞的代數，而僅代表傳代操作的次數。傳代對細胞的影響或傷害程度僅次于將活細胞從生物體內取出并進行原代培養的程度。只是因為傳代后的細胞生長并不像剛開始原代培養時那樣緩慢。每經過一次傳代，細胞的生長環境就相應發生一次較大變化。體外生長的細胞若處于動蕩的生活環境中，細胞的遺傳特性往往容易發生改變。經過多次傳代培養的細胞，往往容易轉化為惡性細胞。因此，傳代對細胞生長和性狀會產生不利影響，一般情況下要盡可能減少傳代次數。

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