細(xì)胞劃痕實驗步驟

細(xì)胞劃痕實驗是指將細(xì)胞培養(yǎng)在培養(yǎng)皿或平板上，待細(xì)胞融合后用槍頭或其他硬物在中 央?yún)^(qū)域畫一條線，這條線內(nèi)的細(xì)胞被機械力去除掉了，然后將細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，觀察細(xì)胞向無 細(xì)胞的劃痕區(qū)域遷移的情況，來判斷細(xì)胞的遷移能力。其意義在于：價格低廉，操作簡單， 還有很重要的一點在于細(xì)胞外圍環(huán)境簡單、單純，容易控制，是腫瘤細(xì)胞基本的研究方法。

一、實驗前準(zhǔn)備

實驗開始前，將離心管、吸管筒、移液槍、槍頭，直尺等放入無菌超凈工作臺，以紫外 線照射 30min。然后，采用通風(fēng)機通風(fēng) 3min。 取出無菌 6 孔板，用黑色記號筆在 6 孔板底部，用直尺比著，均勻的劃橫線，大約每隔 0.5~1cm 一道，橫穿過孔，每孔至少穿過 3 條線。每條黑線的上下緣與劃痕交叉點作為觀察 點，這樣一方面便于觀察另一方面可以一次取多個觀察點，最終可以獲得多個數(shù)據(jù)。 畫好橫線后，在板上分別做好標(biāo)記。 取下試劑瓶和離心管上的封口膜，且將每個試劑瓶和離心管擰松，方便后續(xù)試驗的操作。

二、細(xì)胞準(zhǔn)備

取出處于對數(shù)生長期的健康細(xì)胞，吸掉原來的培養(yǎng)液，用無菌 PBS 清洗細(xì)胞。加入 1ml 胰酶消化液消化細(xì)胞，顯微鏡下觀察所有細(xì)胞皺縮變圓后加入培養(yǎng)基終止消化。收 集細(xì)胞懸液于 15ml 離心管中，800rpm/min 室溫離心 5min。用羅氏 CASY 快速細(xì)胞計數(shù)及 活率分析儀進行細(xì)胞計數(shù)，棄去上清，加入培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。，以每孔 1~4×105 細(xì)胞的密度 接種到 6 孔培養(yǎng)板上，在含 10%胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)一天。具體數(shù)量因細(xì)胞種 類不同而不同，掌握為過夜能鋪滿。

三、直線劃痕

取出鋪滿六孔板的細(xì)胞，用 200ul 槍頭垂直于細(xì)胞表面，由孔一端劃向另一端。盡量垂 直于背面的橫線劃痕，槍頭要垂直，不能傾斜。此時可在培養(yǎng)皿的表面清晰看到細(xì)胞表面呈 #字形劃痕。

四、PBS 清洗細(xì)胞及培養(yǎng)

吸掉舊培養(yǎng)基，用無菌 PBS 洗細(xì)胞表面 3 次，去除劃下的細(xì)胞，加入含有 1%胎牛血清 的培養(yǎng)基為陰性對照，及含有相應(yīng)濃度藥物的 1%胎牛血清培養(yǎng)基為藥物刺激組；每組 2 個 復(fù)孔。 輕輕搖動六孔板，使藥物與細(xì)胞培養(yǎng)液充分混合，放入 37 度，5%C02 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

五、結(jié)果觀察

分別取劃痕 0 小時、24hr、48hr 后觀察不同處理組的痕道寬度。 結(jié)果可見：細(xì)胞劃痕后 48h 觀察到對照組細(xì)胞劃痕寬度恢復(fù)約 90％，而藥物抑制組恢 復(fù)約 60％。 表明加入藥物后，由于藥物的作用，使細(xì)胞遷移受到抑制，而未加入藥物的細(xì)胞保持原 有的遷移能力，在 48h 后通過遷移將劃痕掩蓋。

六、注意事項

1、細(xì)胞密度 注意細(xì)胞生長狀況，選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種密度，對不同的細(xì)胞要觀察其貼壁率等，保證 培養(yǎng)終止時密度適當(dāng)。

2、沖洗細(xì)胞緩慢輕柔 在用 PBS 緩沖液沖洗時，注意貼壁緩慢加入，以免沖散單層貼壁細(xì)胞，影響實驗拍照 結(jié)果。

3、低濃度或無血清培養(yǎng) 劃痕 PBS 沖洗后應(yīng)該加入無血清培養(yǎng)基或者低濃度血清培養(yǎng)基，以排除細(xì)胞本身增殖 對實驗的影響。

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