使用流式細胞儀檢測血小板的注意事項

 通過使用使用流式細胞儀可以對血小板進行信號傳遞、細胞骨架 架構、糖蛋白結構、血小板活化反應， 糖蛋白缺陷檢測， RNA含量，血小板抗體等分析檢測。使用流式細胞儀進行血小板分析檢測時需要注意以下幾點：
一)抗體的選擇
選擇CDWorkshop中的單克隆抗體.單克隆抗體反應特異性高,非特異性結合少,
但由于血小板富含FcRⅡ(CD32,Fe Ⅱ受體),而Fc受體對不同抗體亞類具有不同親和力,所以在業類選擇上,對于人的抗體以選擇IgG1為好.
二)抗凝劑的選擇
盡量避免使用肝素;EDTA在室溫20~25℃時其抗凝效果與枸椽酸鹽無差別,但在37℃時,EDTA就會影響蛋白結構及刺激血小板活化.
三)標本的采集
般采少量外周血,收集在玻璃容器或塑料容器中,采血中避免組織液流人血液中;防止氣泡產生;并使用大號針頭(如18號).盡量減少化學、物理的激活因素對血小板的活化作用.標本的放置溫度以15-25℃為宜,4~10℃以下血小板的外形發生改變.
四)抗體標記物的選擇
我們知道,FITC和PE標記是常用的在488nm激發下作為雙標記使用的試劑,PE的熒光強度比FITC強.因為在用單色測定中CD62p和CD63在靜止血小板上均為弱表達,檢測這兩個抗原時用PE標記為宜.而當CD62p和CD63配合一個高強度表達的抗原CD41、CD61或CD42b作為雙標記時,CD62p和CD63卻宜使用FITC標記.
五)樣品固定
使用流式細胞儀同樣可以檢測樣本中的血小板反應力及活化進程；樣本的固定的主要目的為了減少血小板的體外活化,在進行樣本固定時，也可能會破壞部分蛋白質結構,從而增加非特異性染色.所以,除了做體外剌激血小板活化研究和不能及時處理標本外,都應該做標記之后再固定.樣本固定劑一般使用0.5%~1.0%的多聚甲醛即可.
六)緩沖液
在孵育和洗滌過程中經常會使用PBS(0.01 mol/LpH7.2)+BSA.但如果是分析血小板活化過程，由于Tyrode緩沖液中主要含有鎂離子和grape sugar,這兩種物質有利于減少血小板的體外活化。所以在洗滌的時候,也可以使用Tyrode緩沖液。
七)儀器的設置
部分的流失細胞儀需要利用熒光微球微球進行儀器光路和光電信號的控制,使儀器保持相對穩定、靈敏的狀態.當數據采集完成以后,散射光和熒光需要使用對數放大,這時通過調節散射光電壓,使細胞群分布盡量保持在中間位置.調節熒光電壓,使樣品繼發熒光強度落在對數值1內,也可以使用熒光微球或者使用CD4-FITC/CD8-PE雙色標記單抗來做熒光補償.標本至少分析5000個細胞,而且每秒流速不宜超過1000~1500個細胞.
八）數據分析
在活化血小板(CD62p、CD63)等少量表達抗原的檢測中,閾值的設定一般是使非特異性染色的比例控制在1%~2%的范圍內,但要對非特異性染色進行正確的設定依靠儀器的敏感度及試劑的質量.當測定的抗原本身為高表達而要判斷抗原表達的高低度時,需要依據平均熒光強度。
         蘇州阿爾法生物14年專注于生物實驗室儀器設備的供應，所提供的Luminex系列細胞分析儀主要包括Amnis CellStream流式細胞儀，FlowSight多維全景流式細胞分析儀 ；Guava easyCyte微毛管細胞分析儀，Amnis ImageStream x Mk II量化成像分析流式細胞儀以及Muse細胞分析儀等廣泛應用于細胞周期檢查，抗體識別，細胞凋亡檢測，細胞外泌體檢測，細胞結構研究，以及血小板細胞分析等等細胞生物學領域。