應用差速離心法分離外泌體的原理

外泌體是一種小的 (40-100 nm) 細胞外膜囊泡，目前進行外泌體分離的普遍方法是差速離心法。

     應用差速離心法和粒徑分析等是細胞外囊泡 (EV) 研究的重要步驟。已知細胞會分泌許多膜囊泡，這些囊泡的大小、分子含量及其形成機制各不相同 具體取決于細胞的類型 和當前狀態。通常可以辨別出三個主要的 EV 群體：凋亡小體、脫落的囊泡和外泌體  . 凋亡小體是已知較大的囊泡，直徑為 800-5000 nm，由凋亡后細胞的細胞質和質膜成分組成。脫落的囊泡和外泌體由非凋亡細胞釋放。脫落的囊泡，也稱為“胞外體"或有時稱為“微泡"，是由質膜起泡產生的，一般的粒徑尺寸范圍為 (50– 1000 nm)。

   外泌體是內吞起源的小 (40–100 nm) 囊泡群。外泌體和脫落的囊泡都含有特定的蛋白質組、RNA 和, dsDNA 等。不同的細胞外環境富含不同類型的細胞外囊泡。即使由相同的細胞類型形成，不同類別的囊泡也具有不同的核酸特征  。

差速離心法的原理

離心管內粒子的速度，由三種力（離心力、阿基米德浮力和斯托克斯粘性阻力）的平衡決定，如：

其中geff為離心力（加速度），R為旋轉半徑，即粒子距旋轉軸的距離，ω為旋轉角頻率，d為粒子直徑，ρ為質量粒子的密度和 ρ solv和 η 分別是介質的密度和粘度。

    在固定的離心條件（轉速和介質成分）下，粒子速度由粒子的形態和密度決定。密度高于介質密度的粒子沿離心力“向下"運動，而比介質輕的粒子沿與離心力相反的方向“上浮"。對于相似的密度，較大的粒子遷移得更快。因此，在生物學中，離心主要用于按大小（差速和速率區帶離心）或按密度（等密度離心）分離不同的物體。在這項研究中，我們專注于使用差速離心按大小進行顆粒分級。

       與等密度和梯度離心相反，差速離心從離心管內顆粒的均勻初始分布開始。在開始一輪離心過程中，位于管底部附近的一部分目標小顆粒不可避免地與較大顆粒共同沉淀。這種共沉淀導致較小顆粒的產量降低。然而，選擇大顆粒，起初位于管半月板附近，在開始一輪離心過程中可能沒有足夠的時間到達管底，從而污染最后一個離心步驟產生的小顆粒顆粒。

       顯然，交叉污染的程度取決于不同粒子群的相對沉降速度和離心條件。在被分離的粒子的沉降速度之間存在顯著（數量級）差異的情況下，可以有效地優化差速離心協議以獲得目標粒子群的高產量和足夠純度。此外，當不同顆粒部分之間的沉降速率僅存在微小差異時，優化過程不太成功。在這些情況下，取決于離心條件。

       任何外泌體分離方案旨在獲得產量合理且不受細胞碎片、細胞器和凋亡小體污染的外泌體群體，理想情況下，不含其他類型的細胞外囊泡、蛋白質及其聚集體。由于大小差異很大，將外泌體與細胞、細胞碎片和大囊泡分離相對容易。巨大的挑戰是從小的脫落囊泡中純化外泌體，因為它們的大小非常相似。通過差速離心分離這些細胞外囊泡既困難又低效。所以需要根據轉子的特性和要分離的顆粒的特性，來對離心參數應進行調整。因為離心速度與粒子的旋轉半徑成正比，所以離心運動加速。粒子的徑向坐標隨時間t呈指數增長。

離心機轉子的選擇

    使用差速離心法分離外泌體主要需要注意的是轉子的選擇。“擺動桶"(SW) 轉子和“定角"(FA) 轉子， 這些轉子的幾何形狀根本不同，因此沉降特性也不同。這些轉子之間的主要區別在于： FA 轉子，與旋轉半徑相比，沉積顆粒的較大路徑長度通常較小，允許近似恒定遷移率并簡化描述。然而，第二個區別是圓形 FA 管的水平橫截面是橢圓形的，不同粒子的路徑長度根據軌跡與橢圓長軸的距離而不同。由于較短的路徑長度，外圍顆粒可能沉降得更快，需要根據不同的實驗需要進行選擇。

蘇州阿爾法生物提供的超速離心機、低速離心機、落地式離心機、臺式離心機、納米粒徑分析儀廣泛應用于差速離心法分離外泌體及外泌體形態、電位、粒徑分析等實驗。