熒光定量PCR實驗中PCR儀器選購技巧

聚合酶鏈反應 (PCR) 技術是無數研究和測試實驗室的主要技術，涉及的領域包括生物醫學、基因編輯、食品微生物學測試 等。熒光定量PCR技術使用熱循環來促進一系列反應，在這些反應中，DNA 樣本會快速、呈指數地復制，從而產生數百萬或數十億個序列拷貝。購買PCR儀器時，重要的是要考慮您的應用的最終目標、熱循環設備的準確性和效率以及儀器的容量和靈活性。本文概述了 PCR儀器可用的不同選項和功能，以幫助您選購合適的PCR儀 。

1. PCR 與 qPCR 與 dPCR

雖然所有 PCR 系統都使用聚合酶鏈式反應復制 DNA，但不同的系統使用不同的方法來獲得特定的結果。這些不同的方法包括標準 PCR、定量 PCR (qPCR) 和數字 PCR (dPCR)。

標準 PCR 儀器通常用于擴增 DNA 以供進一步下游測試和使用；從某種意義上說，這項技術被用作生成產品的一種手段，而不是作為一種分析測試方法本身。擴增的 DNA 只能在 PCR 反應完成后進行測量，而不是實時測量，因此這種方法有時被稱為終點 PCR。傳統 PCR 擴增的最終產物通常用于下游克隆和測序，也可以使用凝膠電泳進行檢查，以在低分辨率（基于條帶強度）下確認目標序列的存在及其相對數量。

為了更快速、更準確地定量樣品中存在的目標序列的數量，定量 PCR (qPCR)，也稱為實時 PCR，在擴增過程中使用熒光探針來監測每個熱循環后存在的 DNA 數量。通過觀察需要多少個循環才能達到特定的熒光強度閾值，分析人員可以在將結果與標準曲線進行比較時確定起始材料中的 DNA 量。 qPCR 還可以比普通 PCR 更快地確認目標序列的存在或不存在，例如 SARS-CoV-2 的檢測（使用逆轉錄首先將病毒 RNA 轉化為 cDNA） .

數字 PCR (dPCR) 是另一種定量方法，其中 PCR 反應在數千個獨立的反應室中進行，原始樣品中 DNA 分子的絕對數量可以根據擴增完成后有多少反應室產生熒光信號來確定. 與 qPCR 不同，熒光測量不是實時進行的，也不需要標準曲線來量化樣品中的 DNA。雖然 dPCR 通常具有有限的通量和比 qPCR 更高的成本，但它在量化 DNA 方面更加精確、靈敏和準確，并且在檢測罕見突變和單核苷酸多態性 (SNP) 等應用中較有用。

當您考慮您的應用時，決定是選擇終點（定性/半定量）PCR 還是定量（qPCR 或 dPCR）方法相對簡單，但 qPCR 和 dPCR 之間的選擇可能更加微妙。qPCR 具有高通量、經濟高效且對許多應用足夠靈敏，但如果具有低檢測限的絕對量化至關重要，則 dPCR 可能是更好的選擇。

2.溫度控制的重要性

熱循環儀準確有效地調節和控制樣品溫度的能力是擴增反應成功的關鍵，應該成為選擇任何 PCR 系統的重點。不同的系統可能在升溫速率、溫度均勻性和準確性以及跨熱塊實現溫度梯度以幫助 PCR 方法優化的能力方面提供不同的能力。

升溫速率是指熱循環步驟之間溫度變化的速度，在儀器規格中通常表示為每秒攝氏度 (°C/sec)。制造商可能會提供有關最大斜率和平均斜率的信息，并區分儀器的上升斜率（加熱）和下降斜率（冷卻）。

一般來說，更高的斜坡率對應于更快的運行時間，但購買者應注意不要只關注MAX斜坡率而不檢查與儀器速度相關的其他指標。儀器可能只會在短時間內達到其較高升溫速率，而平均升溫速率將更好地反映溫度變化的速度。雖然升溫速率規格可能給出某些儀器可以運行多快的一般概念，但在可能的情況下，尋找儀器上展示的實際運行時間的數據，以真實地了解高升溫速率如何轉化為快速分析。朗基T30 PCR儀的升溫速度甚至可以達到7.5℃/sec。

溫度的準確性和均勻性也是成功反應的關鍵，雖然所有熱循環儀的設計都是為了產生 PCR 所需的溫度，但某些功能可以提供更高的置信度，這對于樣品可能有限且結果可靠的應用至關重要。當使用PCR儀器進行高分辨率熔解 (HRM) 分析等敏感技術時，精確的溫度控制也至關重要。

加熱的蓋子可以確保整個 PCR 管更好的溫度均勻性，因為沒有加熱的蓋子，樣品會蒸發并凝結到溫度較低的管頂部。熱塊設計也會影響溫度控制；鋁塊導電性低，這意味著它們將比更導電的塊更慢地實現溫度均勻性并且具有更低的升溫速率。鍍銀和鍍金的模塊雖然昂貴，但可以更快地進行熱傳遞，從而確保整個塊的溫度分布均勻。

不同的 DNA 目標可能需要不同的溫度才能獲得較好的擴增結果；例如，富含 GC 的序列需要更高的溫度才能變性。理想的退火溫度也受到一系列因素的影響——而該步驟的溫度通常是根據引物的解鏈溫度、引物對之間解鏈溫度的差異以及試劑濃度、pH 和鹽濃度的影響來選擇的。使優化反應溫度條件成為一項復雜的任務。

具有溫度梯度能力的 PCR 儀器旨在通過允許在單次運行中測試多個退火溫度來幫助優化 PCR 方法。根據您計劃使用 PCR 儀器分析的樣品類型和多樣性，帶梯度功能的PCR儀器雖然價格稍高于普通PCR儀，但對工作效率提升不少。比如：朗基系列的 A600系列。

3.加熱模塊

如前所述，與 PCR 儀器一起使用的加熱塊可以在溫度控制方面產生差異，但加熱塊的設計——以及儀器適應不同加熱塊的設計——也會影響通量、耗材成本和靈活性。典型的塊將采用 96 孔或 384 孔格式，但也可提供其他格式，如 48 孔和 1536 孔。孔數越高，反應體積越小，吞吐量越高，最初成本更高，但由于每個孔使用的試劑量較少，最終會降低每次反應的價格。選擇時需要考慮您要處理的樣品數量以及您使用儀器的頻率。

一些PCR儀器帶有固定模塊，而其他儀器允許使用可互換塊，從而提供較大的靈活性，可以在 96 孔和 384 孔格式之間或在不同應用的不同塊材料之間切換。一些熱循環儀還在同一臺儀器中容納多個模塊，使不同的協議能夠同時在不同的樣本集上運行。比如：朗基的Q2000B熒光定量PCR儀同時用擁有4通道檢測，適用低位的PCR管、8聯排管或96孔板。

由于此組件在溫度控制、樣品處理和通量方面的關鍵作用，因此在選擇熱循環儀時應仔細考慮熱塊選項。對于樣品量較少的實驗室，或者那些通常只進行少量檢測的實驗室，具有標準 96 孔的低成本固定塊儀器可能就足夠了。然而，模塊化、靈活的儀器可能有利于具有更多協議、不同樣本量和更多用戶依賴同一儀器進行自己的分析的實驗室，以及可能希望在未來擴大其通量能力的實驗室。

蘇州阿爾法生物14年專注生物實驗室儀器設備供應和實驗試劑、實驗室耗材供應的服務商，提供的PCR儀器、熒光定量PCR儀、梯度PCR儀、高通量PCR儀等用于分子生物學研究、生命科學等領域