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PriCells: 正常大鼠前脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)
正常大鼠前脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)
實驗材料：
1. 細(xì)胞來源：4周齡雄性Wistar或其它品系大鼠；
2. 清洗液：不含Ca2+和Mg2+的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L鏈霉素，pH7.4；
3. 消化液：2mg/ml膠原酶溶液。用DMEM培養(yǎng)液配制，并加入牛血清白蛋白20mg/ml；
4. 培養(yǎng)液a：DMEM培養(yǎng)液，10%胎牛血清、100IU/ml青霉素、50μg/ml鏈霉素；
5. 培養(yǎng)液b：在培養(yǎng)液a中補充生物素33μmol/L與泛酸鹽（pantothenate）17μmol/L；
6. 培養(yǎng)液c：基礎(chǔ)培養(yǎng)液為DMEM/Ham F12（1：1，V/V）混合培養(yǎng)液，加入NaHCO3 15mmol/L、HEPES 15mmol/L，pH7.4。再加入生物素33μmol/L與泛酸鹽17μmol/L及100IU/ml青霉素、50μg/ml鏈霉素；
7. ITT培養(yǎng)液：在培養(yǎng)液c的基礎(chǔ)上添加胰島素5μg/ml、轉(zhuǎn)鐵蛋白10μg/ml和三碘甲腺原氨酸（T3）200pmol/L；
8. 篩網(wǎng)：孔徑為25μm的尼龍網(wǎng)篩；
實驗方法：
1. 取材；
1） 取用普通食物喂養(yǎng)的4周齡雄性大鼠，yi醚麻醉后斷頭處死；
2） 在無菌條件下從附睪周圍切取脂肪墊，放入培養(yǎng)皿中。盡量除去血管。然后用清洗液沖洗3次；
2. 分離細(xì)胞；
1） 充分剪碎所取脂肪細(xì)胞。然后放入消化液中，37℃水浴中振蕩消化40min；
2） 將含有細(xì)胞和殘余組織塊的消化液倒入加有培養(yǎng)液a的燒杯中，用吸管反復(fù)吹打。然后通過孔徑為25μm的尼龍網(wǎng)篩。分別收集濾液和未濾過的組織塊；
3） 將濾液以600g離心5min，棄上清液。在管中加入培養(yǎng)液b，制成SV細(xì)胞懸液，暫存入4℃冰箱中；
4） 合并兩次制備所獲的SV細(xì)胞懸液。用吸管吹打混勻。取少量SV細(xì)胞懸液，計數(shù)細(xì)胞。注意在計數(shù)時不要計入血細(xì)胞。根據(jù)需要調(diào)節(jié)細(xì)胞密度；
3. 原代培養(yǎng)；
1） 以104個/cm2的密度將細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，加入培養(yǎng)液b。于37℃、3.5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12—24h；
2） 在細(xì)胞貼壁后，用培養(yǎng)液c清洗2次。然后加入培養(yǎng)液c過度培養(yǎng)1h；
3） 棄瓶中的培養(yǎng)液c，用PBS洗細(xì)胞2次；
4） 以后用ITT培養(yǎng)液維持培養(yǎng)。每3d換液一次；
PriCells提供：
1. 各種原代細(xì)胞特制基礎(chǔ)培養(yǎng)基；
2. 各種原代細(xì)胞培養(yǎng)特制添加劑；
3. 原代細(xì)胞分離試劑盒；
4. 原代細(xì)胞鑒定試劑盒；
5. 原代細(xì)胞總蛋白質(zhì)抽提物；
6. 原代細(xì)胞總RNA；
7. 原代細(xì)胞總DNA；