5
PriCells: 正常小鼠前脂肪細胞的培養
PriCells: 正常小鼠前脂肪細胞的培養
實驗材料：
1. 細胞來源：8—12天齡的小鼠；
2. 清洗液：不含Ca2+和Mg2+的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L鏈霉素，pH7.4；
3. 消化液：0.3%膠原酶溶液，含4%牛血清白蛋白。用Hanks液配制；
4. DW培養液：DMEM和WAJC404培養液按1：1（V/V）混合，添加100IU/ml青霉素、50μg/ml鏈霉素；
5. 培養液a：DW培養液，10%胎牛血清；
6. 培養液b：DW培養液，補充胰島素10μg/ml、轉鐵蛋白10μg/ml、成纖維細胞生長因子（FGF）10ng/ml和高密度脂蛋白（HDL）溶液5μl/ml；
7. 高密度脂蛋白（HDL）溶液：含蛋白質18mg/ml和膽固醇10mg/ml；
8. 地塞米松：工作濃度為10-7mol/L；
9. 篩網：孔徑分別為250μm與80μm的尼龍網篩；
實驗方法：
1. 取材；
1） 取8—12天齡的小鼠，窒息處死后，置于冰塊上；
2） 在無菌條件下迅速切取腹股溝的脂肪墊，放入PBS液中；
3） 清除脂肪墊中的大血管和結締組織，洗凈血污。稱取脂肪墊的重量；
2. 分離細胞；
1） 將脂肪墊剪成1mm3左右的小塊，轉入50ml錐形離心管中；
2） 每0.1g組織塊加入3—4ml消化液。在37℃水浴搖床上以60r/min的轉速輕微振蕩，消化1h。其間每隔10min取出離心管，搖動，使組織塊與消化液充分混勻；
3） 消化完后，用吸管反復吹打消化液，分散組織塊，制成細胞懸液；
4） 用孔徑為250μm的尼龍網篩過濾細胞懸液，除去未分散的組織塊，收集濾液。將濾過液再用孔徑為80μm的尼龍網篩過濾，除去大部分成熟脂肪細胞，收集濾液；
5） 將最后得到的濾液離心（700g，7—10min）。吸棄漂浮的脂肪細胞和消化液；
6） 用培養液a清洗細胞，離心（700g，7min）。將細胞團制成懸液，再離心。最后，將細胞沉淀用培養液a重新制成細胞懸液；
3. 原代培養；
1） 用培養液a調節細胞密度。將細胞以1.5×104個/cm2的密度接種于培養板中；
2） 24h后，用DW培養液*清洗細胞，除去培養物中殘留的胎牛血清和未貼壁的細胞（主要為紅細胞）；
3） 換入培養液b，在37℃、5%CO2培養箱中培養。以后用培養液b維持培養。每3d換液一次；
4） 在細胞匯合成片后，繼續培養；或于細胞匯合成片后第五天，在培養液b中加入10-7mol/L地塞米松，繼續培養；
5） 培養至出現漂浮細胞時，即可收貨細胞，進行鑒定；
PriCells提供：
1. 各種原代細胞特制基礎培養基；
2. 各種原代細胞培養特制添加劑；
3. 原代細胞分離試劑盒；
4. 原代細胞鑒定試劑盒；
5. 原代細胞總蛋白質抽提物；
6. 原代細胞總RNA；
7. 原代細胞總DNA；